雙氫睪酮體外培養(yǎng)人毛囊中差異表達的miR-133b對人毛乳頭細(xì)胞的增殖及誘導(dǎo)能力的影響

鄧文佳，鄧長健，韓 樂，劉 本，唐 鑫，萬苗堅

（1.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚性病科，廣東廣州 510630；2.龍崗區(qū)人民醫(yī)院耳鼻咽喉科，廣東深圳 518172）

雄激素源性脫發(fā)（androgenetic alopecia，AGA）又稱男性型脫發(fā)（male pattern baldness，MPB）是臨床最常見的脫發(fā)疾病。近年來，雄激素源性脫發(fā)的發(fā)病逐漸呈現(xiàn)年輕化的趨勢，它不但可以對患者容貌、精神心理健康產(chǎn)生不利影響，甚至嚴(yán)重干擾患者正常社交生活［1-2］。AGA 的發(fā)生發(fā)展由雄激素主導(dǎo)，特征表現(xiàn)為特定部位的毛囊的微型化，如前額及頂部頭皮，受累毛囊可逐漸萎縮甚至消失，造成毛囊密度的明顯降低，伴有一定的遺傳傾向［3-4］。毛囊是一個由上皮及間葉組織組成的皮膚附屬器，其生長具有獨特的周期特性，由生長期、退行期及休止期構(gòu)成［5］。上皮組織與間葉組織之間的聯(lián)系對毛囊的生長發(fā)育起到至關(guān)重要的作用［6-7］。毛乳頭（dermal papilla，DP）亦稱真皮乳頭，主要由間葉組織細(xì)胞組成，在生長期毛發(fā)中，可激活毛囊周圍包繞著它的毛母質(zhì)細(xì)胞以維持及啟動毛囊生長周期［8］。毛囊的生長周期，受局部雄激素的影響，其中主要為雙氫睪酮（5α-dihydrotestosterone，DHT），研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的DHT 可引起毛乳頭細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致毛發(fā)周期異常［9］。過去，AGA 在基因方面的研究主要著重于編碼基因。近幾年，非編碼基因逐漸被發(fā)現(xiàn)在許多細(xì)胞活動中引起關(guān)鍵作用。MicroRNAs（miRNAs）作為一類內(nèi)源性非編碼RNAs（長度通常為約22～42 核苷酸），通常通過降解mRNAs 或抑制翻譯過程從而影響靶基因的表達，與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化及生長等過程密切相關(guān)［10］。已有許多不同miRNAs 被發(fā)現(xiàn)在毛囊的發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用。miR-133b 在心臟及骨骼肌中高度富集，是肌肉發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一［11］，但近幾年，越來越多的研究表明miR-133b不僅在肌肉組織中表達，其在人類腫瘤以及腦卒中樣本中亦呈現(xiàn)異常表達［12-13］。近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-133b 在雄激素刺激的激素敏感性前列腺癌細(xì)胞中表達明顯上調(diào)，當(dāng)miR-133b缺乏時，雄激素刺激前列腺癌細(xì)胞的能力將被抑制，提示miR-133b 為介導(dǎo)雄激素刺激前列腺癌細(xì)胞生存能力的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［14］。另外，在骨肉瘤及肝癌細(xì)胞中，研究表面人為上調(diào)miR-133b 可以通過miR-133b/Sirt1 軸干擾Wnt/β-catenin 信號通路達到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷徙能力及誘發(fā)凋亡的作用［15-16］。我們的前期研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin 信號通路在DHT 調(diào)控毛囊的生長中發(fā)揮重要作用［17］。但miR-133b是否參與該過程目前尚未明確。因此，本文擬探究不同濃度雙氫睪酮對毛囊生長和毛囊細(xì)胞增殖的影響及其與miR-133b 表達的關(guān)系，并進一步探究miR-133b 對毛乳頭細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)能力的影響，有望今后治療AGA提供方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毛囊標(biāo)本及細(xì)胞來源 人頭皮樣本來源于中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院皮膚科和腦外科以及廣州市粵秀整形醫(yī)院整形手術(shù)中枕部或額頂部廢棄的男性頭皮。共5 例，平均年齡25.6（S＝3.9）。供皮區(qū)頭皮完整正常，毛發(fā)密度及生長正常，無脫發(fā)、感染等毛發(fā)相關(guān)疾病，近半年未使用激素、免疫抑制劑等其他藥物，局部未使用育發(fā)或染發(fā)類產(chǎn)品及藥物。本研究經(jīng)中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，志愿者均需簽署知情同意書。人毛乳頭細(xì)胞購置于美國ScienCell公司。

1.1.2 主要試劑 雙氫睪酮（Sigma，美國，溶于無水乙醇配成10-2mol/L 母液）；配制的Williams E 無血清培養(yǎng)基（Gibco，美國，各成分終濃度：4-羥乙基哌嗪乙磺酸（Hepes）2 mmol/L、谷氨酰胺2 mmol/L、牛胰島素10 mg/L、氫化可的松10 μg/L、亞硒酸鈉10 μg/L、轉(zhuǎn)鐵蛋白10 mg/L、青霉素1×105μg/L、鏈霉素100 mg/L）；DMEM 培養(yǎng)基（Gibco，美國）；胎牛血清（Gibco，美國）；兔抗人Ki-67 抗體（Sigma，美國）；兔抗人Actin 抗體（Millipore，美國）；兔抗人ALP 抗體（Abcam，美國）；兔抗人Versican 抗體（Abcam，美國）；兔抗人β-catenin 抗體（Abcam，美國）；山羊抗兔熒光二抗（Abcam，英國）；牛血清白蛋白（BSA）（索萊寶，北京）；6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（碧云天，上海）；抗熒光淬滅封片劑、4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；碧云天，上海）；CCK-8 試劑盒（DOJINDO，日本）；Trizol（Invitrogen，美國）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本）；qPCR 試劑盒（Takara，日本）；Lipofectamine2000（Invitrogen，美國）。

1.2 方法

1.2.1 毛囊分離與培養(yǎng) 術(shù)中廢棄的頭皮浸泡在生理鹽水中，冰上保存，4 h內(nèi)分離培養(yǎng)。首先以生理鹽水清洗頭皮，去除血液，轉(zhuǎn)移至青霉素（200 U/mL）鏈霉素（200μg/mL）雙抗的D-Hanks 緩沖液中沖洗約3 min，再轉(zhuǎn)移至青霉素（100 U/mL）鏈霉素（100μg/mL）雙抗的D-Hanks 緩沖液中沖洗2 次，每次2 min。在解剖顯微鏡下，用10 號刀片沿毛囊生長方向?qū)㈩^皮縱向分為粗胚、細(xì)胚、單株毛囊，小心去除毛囊周圍的真皮和脂肪組織，在表真皮交界處切斷毛囊，選擇結(jié)構(gòu)完整的生長期Ⅵ期毛囊進行培養(yǎng)。全過程在冰上進行。

將配制的Williams E 無血清培養(yǎng)基以每孔500μL 加入24 孔培養(yǎng)板中。用顯微鑷將分離的毛囊置于培養(yǎng)板中，每孔1 根，將毛囊完全浸入培養(yǎng)基中。在倒置顯微鏡下觀察并采集每根毛囊毛球部的形態(tài)變化圖像以及測量毛囊初始長度。將培養(yǎng)板置于37 ℃體積分?jǐn)?shù)為5%CO2的培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)24 h 后挑選生長良好且平均長度為0.35 mm（S＝0.05 mm）的毛囊進行分組培養(yǎng)，每組有15 根毛囊，分別加入含有濃度分別為10-8、10-7、10-6和10-5mol/L的DHT 以及不添加的DHT 的Williams E 無血清培養(yǎng)基中，各組培養(yǎng)基中無水乙醇濃度一致，每日在倒置顯微鏡下觀察并拍攝每根毛囊毛球部的形態(tài)變化以及測量毛囊初始長度。

1.2.2 免疫熒光技術(shù)評估毛囊毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖情況 選取體外培養(yǎng)8天的毛囊分別用40 g/L多聚甲醇固定后進行石蠟包埋，沿毛囊縱軸方向?qū)⑾瀴K切成厚度約為3 μm 石蠟切片，在鏡下選擇毛囊結(jié)構(gòu)完整的切片浸泡于二甲苯中脫蠟2 次，梯度乙醇（100%、85%、75%）水化，用蒸餾水沖洗后將切片浸泡入乙二胺四乙酸（EDTA）修復(fù)液（pH=8.0）中高壓抗原修復(fù)，室溫自然冷卻后磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，滴加用5% BSA 配制好的Ki-67 一抗30μL 充分覆蓋毛囊組織，4 ℃濕盒內(nèi)孵育過夜。PBS洗滌切片3 次，加入稀釋好的熒光二抗約30μL 室溫避光靜置1 h，PBS 再次洗滌3 次后滴加DAPI 10μL室溫避光孵育10 min，PBS清洗后封片。于熒光顯微鏡下觀察并拍攝毛囊圖像。

1.2.3 人毛乳頭細(xì)胞的培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 將購置的人毛乳頭細(xì)胞復(fù)蘇后轉(zhuǎn)移到含10%FBS 的DMEN 培養(yǎng)基中，置于體積分?jǐn)?shù)5%CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞生長至60%～70%后傳代，轉(zhuǎn)染前細(xì)胞匯合達到70%～90%，按3×105細(xì)胞/孔接種在6 孔板中，按照Lipofectamine 2000 說明書，將適宜濃度的miR-133b mimics 或miR-133b-NC 轉(zhuǎn)染至人毛乳頭細(xì)胞中，培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞進行下一步檢測。相關(guān)序列如下，miR-133b mimics：5’-UUUGGUCCCCUUCAACCAGCUA-3’；miR-133b-NC：5’-GGGAGUGAAGACACGGAGCCAGA-3’，miR-133b-NC 為無同源性的隨機序列，上述序列均由上海生工生物工程公司合成。

1.2.4 CCK-8 檢測人毛乳頭細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染人毛乳頭細(xì)胞48 h 后，將各組細(xì)胞消化下來，以3×103/孔的密度接種至96 孔板中，每組設(shè)置3 個復(fù)孔，置于體積分?jǐn)?shù)5% CO237 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h后，依照CCK-8 試劑盒說明書將10 μL CCK-8 檢測試劑添加到每孔中，在37 ℃下孵育1～4 h，應(yīng)用酶標(biāo)儀450 nm波長處測量吸光度。

1.2.5 總RNA 提取-逆轉(zhuǎn)錄-qPCR 檢測 用Trizol試劑提取總RNA，并檢測其濃度及純度，依照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將RNA 轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物均由Invirtrogen 公司設(shè)計，以Actin 作為內(nèi)參基因，相關(guān)引物序列為：Actin 上游5’-CACAGAGCCTCGCCTTTGC-3’和下游5’-GCGCGGCGATATCATCATCC-3’；miR-133b 上游 5’-GGGTTTGGTCCCCTTCAAC-3’和下游5’-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3’；ALP上游5’-CTTCAGGTCAAGAGGCTGGGC-3’和下游5’-AATCAGGGAGAACTGTGTCCCG-3’；Versican 上游5’-AGGTGGTCTACTTGGGGTGA-3’和下游5’-TGCAGCGATCAGGTCGTTT-3’；β-catenin 上游5’-GCGCCATTTTAAGCCTCTCG -3’和下游5’-CTGAAGCTGCTCCTCAGACC-3’；依照qPCR 試劑盒說明書，配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件設(shè)置為95 ℃30 s，95 ℃3 s，60 ℃34 s，循環(huán)40次。

1.2.6 蛋白免疫印跡檢測 轉(zhuǎn)染人毛乳頭細(xì)胞48 h 后按常規(guī)方法提取總蛋白，用5%濃縮凝膠和12%分離凝膠進行SDS-PAGE 電泳，上樣量為總蛋白20μg，濃縮的凝膠在60 V電泳60 min，分離的凝膠在120 V 電泳70 min，濕轉(zhuǎn)移100 V 60 min 后以5%BSA 封閉1 h，1×TBST 洗膜后相應(yīng)一抗4 ℃孵育過夜，1×TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h 后，再次以1×TBST 洗膜3 次，每次10 min，進行ECL 化學(xué)發(fā)光、X 射線膠片顯影，使用Image J 軟件分析蛋白質(zhì)表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用IBM SPSS Statistics 22.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以表示，兩組間比較，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布且滿足方差齊性采用t檢驗；多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，當(dāng)滿足方差齊性的情況下，使用Dunnett-t法進行進一步的兩兩比較，當(dāng)不滿足方差齊性的情況下采用Dunnett’sT3法進行進一步的兩兩比較，α=0.05，P＜0.05 表明差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 毛囊生長長度

將毛囊分組培養(yǎng)在配制好的William’s E 培養(yǎng)基中或添加10-8～10-5mol/L DHT 的培養(yǎng)基中，每天換液并且測量毛囊延長長度?？捎^察到各組毛囊生長良好，表現(xiàn)為毛干明顯伸長突出毛囊頂端，方差分析顯示5 組間毛囊生長長度差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.279，P＜0.001），采用Dunnett-t法進一步進行兩兩間比較，對照組與DHT 10-8、10-7和10-6mol/L實驗組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義，僅DHT 10-5mol/L實驗組的毛囊生長長度較對照組明顯縮短（P＜0.05），其中，對照組以及DHT 10-5mol/L 實驗組毛囊生長長度分別為（0.464 1±0.086 9）mm、（0.345 3±0.112 1）mm。選擇與對照組毛囊生長速度存在統(tǒng)計學(xué)差異的10-5mol/L 實驗組毛囊用于后續(xù)實驗（圖1）。

圖1 不同濃度雙氫睪酮體外培養(yǎng)人毛囊生長長度的比較Fig.1 Comparison of the length of human HFs growth treated by different concentrations of DHT in vitro

2.2 毛囊形態(tài)改變及毛囊毛母質(zhì)細(xì)胞的增殖

倒置顯微鏡下可以觀察到，對照組在培養(yǎng)第8天開始進入退行期早期，表現(xiàn)為毛母質(zhì)形態(tài)變細(xì)，毛乳頭逐漸橢圓，毛干黑色素明顯減少，毛囊彎曲扭折等，對比可見，DHT10-5mol/L 實驗組則于第6天開始出現(xiàn)退行表現(xiàn)（圖2A）。經(jīng)免疫熒光染色后，Ki-67 陽性分子呈現(xiàn)綠色熒光（白色箭頭所指為核內(nèi)綠色熒光），主要于毛母質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中表達。t檢驗顯示，與對照組相比，10-5mol/L 實驗組中毛母質(zhì)細(xì)胞中的Ki-67陽性細(xì)胞減少（t=2.928，P＜0.05；圖2B、C）。

圖2 不同濃度DHT體外培養(yǎng)人毛囊的形態(tài)變化、增殖及miR-133b表達的影響Fig.2 Effects of different concentrations of DHT on human HFs’morphology，proliferation and miR-133b expression in vitro

2.3 體外培養(yǎng)人毛囊中miR-133b的表達量

培養(yǎng)8 天的體外人毛囊，研磨后提取總RNA后進行qRT-PCR 檢測，分別檢測各組中miR-133b的表達。t檢驗顯示，與對照組相比，DHT10-5mol/L 實驗組毛囊中miR-133b 的相對表達量明顯升高，相 當(dāng) 于 對 照 組 的（0.13±0.09）倍（P＜0.01；圖2D）。

2.4 上調(diào)miR-133b 對人毛乳頭細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)能力的影響

2.4.1 上調(diào)miR-133b對人毛乳頭細(xì)胞增殖能力的影響 分別用miR-133b NC及miR-133b mimics轉(zhuǎn)染人毛乳頭細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后將細(xì)胞消化至96 孔板中，48 h后進行CCK-8實驗，檢測450 nm 處吸光值。miR-133b NC 組OD 值 為1.750±0.104，miR-133b mimics 組OD 值為1.377±0.101，miR-133b mimics組吸光度值明顯低于miR-133b NC 組（t=4.476，P＜0.05；圖3A）。

2.4.2 上調(diào)miR-133b對人毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)能力的影響 轉(zhuǎn)染48 h 后，提取總RNA 進行qRT-PCR 檢測，與miR-133b NC 組相比，miR-133b mimics 組毛囊中ALP、Versican、β-catenin的相對表達量均明顯下降，分別相當(dāng)于miR-133b NC組的0.21±0.02倍（t=17.40，P＜0.001）、0.50±0.07 倍（t=9.90，P＜0.01）、0.31±0.10 倍（t=8.92，P＜0.01）。提取總蛋白進行western blot 檢測，miR-133b NC 組 與miR-133b mimics 組相比，ALP 條帶的灰度值分別為0.29±0.03、0.12±0.02，即miR-133b mimics 組的ALP 蛋白相對表達量低于miR-133b NC 組（t=8.29，P＜0.01）；同樣，Versican 的灰度值在miR-133b NC 組與miR-133b mimics 組分別為0.37±0.02、0.13±0.02，βcatenin 灰度值0.18±0.02、0.07±0.02，提示miR-133b mimics組的Versican、β-catenin 蛋白相對表達量 低 于miR-133b NC 組（tVersican=13.16，P＜0.001；tβ-catenin=6.74，P＜0.01）。

圖3 miR-133b mimics對人毛乳頭細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)能力的影響Fig.3 Effects of miR-133b mimics on human dermal papille cells in vitro

3 討論

在本研究中，通過體外分離培養(yǎng)毛囊，我們發(fā)現(xiàn)抑制毛囊生長及增殖的高濃度的DHT 可調(diào)控毛囊中miR-133b 的表達顯著上調(diào)。通過細(xì)胞培養(yǎng)，我們進一步發(fā)現(xiàn)這種對毛囊的抑制作用可能是雄激素通過調(diào)控miR-133b的表達抑制人毛乳頭細(xì)胞的增殖活性及誘導(dǎo)能力實現(xiàn)的。

體外分離的毛囊因保留了毛囊中真皮組織與上皮組織的聯(lián)系，常作為探究毛發(fā)生長的理想模型。通常在體外培養(yǎng)時，毛囊普遍于第8～10 天開始退行，伴隨其生長速度減慢［18］。Winiarska 等［9］發(fā)現(xiàn)，相較10-7、10-6mol/L 等濃度，10-5mol/L濃度下的DHT處理6 d時抑制毛乳頭細(xì)胞增殖的作用最為顯著，提示DHT 促進毛乳頭細(xì)胞凋亡的能力具有一定的濃度與時間依賴性。同樣，我們的研究也發(fā)現(xiàn)，在體外，較高濃度的DHT 如10-5mol/L 環(huán)境中培養(yǎng)的人毛囊，生長受到抑制的現(xiàn)象最顯著。另外，我們的前期研究［17］表明低濃度如10-7mol/L 的DHT可對毛囊的生長產(chǎn)生促進作用，提示DHT 對體外毛囊生長的作用可呈現(xiàn)雙向劑量反應(yīng)，這或許與DHT 調(diào)控毛乳頭細(xì)胞中的活性氧（ROS）水平的機制相關(guān)［19］。研究［20-21］表明，作為胞內(nèi)的一種信號分子，低濃度的ROS 可增加細(xì)胞增殖活性，亦可通過TNF-α 激活Wnt/β-catenin 信號通路，誘導(dǎo)毛囊進入生長期，但高濃度的活性氧可對毛囊細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，抑制毛囊生長。

對于生長期毛囊，Ki-67 是評估其增殖活性的重要指標(biāo)，僅處在增殖期的毛母質(zhì)細(xì)胞才能表達Ki-67［22］。結(jié)合免疫熒光檢測及qRT-PCR，10-5mol/L DHT 實驗組的毛母質(zhì)細(xì)胞增殖活性明顯受到抑制，進一步驗證了10-5mol/L DHT 對毛囊的生長并縮短生長期，在該濃度刺激下miR-133b 的表達顯著上調(diào)，提示miR-133b 的表達與雄激素影響毛囊生長及毛囊細(xì)胞的增殖活性可能存在一定負(fù)性相關(guān)性。這與其在雄激素刺激的激素敏感性前列腺癌細(xì)胞中被觀察到的趨勢一致。

miRNAs作為一類高度保守的非編碼RNAs，與細(xì)胞的增殖、凋亡、分化及生長等過程密切相關(guān)［10］。已有許多不同miRNAs 被發(fā)現(xiàn)在毛囊的發(fā)生發(fā)展中起到非常重要的作用，如miR-214被檢測到可以通過調(diào)控Wnt/β-catenin 通路影響鼠類胚胎毛囊的發(fā)育［23］；miR-205 及miR-125b 分別被發(fā)現(xiàn)與毛囊干細(xì)胞的增殖與分化息息相關(guān)［24-25］。miR-133b 最初一直被認(rèn)為是肌肉組織高度保守的miRNA。近期的相關(guān)研究證實，在骨肉瘤及肝癌腫瘤細(xì)胞中，人為上調(diào)miR-133b 可以通過miR-133b/Sirt1 軸干擾Wnt/β-catenin 信號通路達到抑制腫瘤細(xì)胞增殖、遷徙能力及誘發(fā)凋亡的作用［15-16］。但miR-133b 在AGA 的發(fā)生發(fā)展中的作用尚不清楚。我們上調(diào)人毛乳頭細(xì)胞中的miR-133b 表達后，通過CCK-8 實驗發(fā)現(xiàn)人毛乳頭細(xì)胞增殖能力的顯著下降。同時，結(jié)合qRT-PCR 及western blot 實驗發(fā)現(xiàn)人毛乳頭細(xì)胞誘導(dǎo)能力的指標(biāo)如Versican［26］、ALP［27-28］、β-catenin［29］，相關(guān)基因及蛋白表達均顯著下降，提示過表達miR-133b 可抑制人毛乳頭細(xì)胞增殖能力及誘導(dǎo)能力。這與腫瘤組織中觀察到的作用一致。

本研究僅初步證明AGA 的發(fā)病機制可能是由于高濃度的雄激素通過上調(diào)miR-133b的表達抑制人毛乳頭細(xì)胞的增殖活性及誘導(dǎo)能力，但本研究仍存在許多不足之處。首先，本研究僅通過過表達miR-133b，未做低表達實驗將其與雄激素共處理，因此不能完全證實miR-133b在雄激素影響毛發(fā)生長中的作用。其次，毛囊作為組織器官，其細(xì)胞成分及環(huán)境復(fù)雜，除毛乳頭細(xì)胞外，miR-133b 亦可能通過其他細(xì)胞及細(xì)胞環(huán)境影響毛發(fā)生長發(fā)育，不能反映體內(nèi)復(fù)雜環(huán)境下的毛囊發(fā)生發(fā)展。這有待于進一步的研究。