阿魏酸通過胰島素/IGF信號通路和DAF-16促進(jìn)秀麗隱桿線蟲壽命和應(yīng)激抵抗力

況琪斐，陳巧超，張 玲，何 文，裴 中

（1.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)科，廣東廣州 510080；2.中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東廣州 510080）

衰老和疾病是生命科學(xué)領(lǐng)域的熱門研究領(lǐng)域。衰老的本質(zhì)是由于被動(dòng)的隨機(jī)錯(cuò)誤積累（隨機(jī)老化理論）或主動(dòng)的非隨機(jī)過程（程序老化理論）導(dǎo)致身體結(jié)構(gòu)和功能隨年齡而發(fā)生的退化［1］。許多與年齡有關(guān)的疾病，包括癌癥、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病，將變得越來越普遍［2］。如果能夠有效地控制衰老的進(jìn)程，那么疾病的數(shù)量將減少，人類的壽命和健康狀況將得到有效改善。迄今為止，雖然藥物干預(yù)在延緩衰老方面已經(jīng)取得了一定的效果，但目前還沒有獲得國家藥監(jiān)局批準(zhǔn)的抗衰老藥物，因此尋找天然有效的抗衰老藥物十分重要［3］。秀麗隱桿線蟲（Caenorhabditis elegans，C.elegans）是研究衰老的經(jīng)典生物學(xué)模型。秀麗隱桿線蟲具有壽命短，易于培養(yǎng)，體積小的優(yōu)點(diǎn)［4］。此外，在秀麗隱桿線蟲的基因中已鑒定出近80%的人類基因同源物。最近的研究表明，特定的遺傳和環(huán)境因素影響線蟲的衰老和壽命［5］。特別注意的是，秀麗隱桿線蟲與人類具有相似的衰老方面，其中壽命的延長與壓力的承受能力有關(guān)［6］。因此，秀麗隱桿線蟲作為模型生物，在鑒定可能有益于長壽的化合物和機(jī)制方面具有很高的價(jià)值。阿魏酸（ferulic acid，F(xiàn)A；3-甲氧基-4-羥基肉桂酸）是大麥顆粒、麥麩、大米胚乳、玉米糠等植物細(xì)胞壁中常見的多酚類化合物［7］。它通過酯鍵與多糖共價(jià)連接［8］。在植物細(xì)胞壁中，脂肪酸可通過阿魏酸酯酶的作用釋放出來［9］。阿魏酸具有廣泛的抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生物活性［10］。阿魏酸在日本被用作食品添加劑的抗氧化劑和食品防腐劑［11］。在中國，治療者們利用阿魏酸的抗氧化性，使用阿魏酸鈉治療心血管和腦血管疾?。?2］。阿魏酸可調(diào)控促炎性NF-κB 及其相關(guān)的基因信號，從而減弱老年大鼠中氧化應(yīng)激引起的炎癥相關(guān)疾?。?3］，也可通過激活中央毒蕈堿和煙堿樣受體和抗氧化酶，從而減少認(rèn)知缺陷的進(jìn)展［14］。然而，其在延長壽命和抗衰老機(jī)制方面的研究甚少，本研究以秀麗隱桿線蟲為模型，對阿魏酸的延緩衰老機(jī)制做進(jìn)一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

阿魏酸（分子式：C10H10O4，分子質(zhì)量：194.18）購自美國Sigma 公司；大腸桿菌（Escherichia coli）OP50、野生型N2 秀麗隱桿線蟲（C.elegans）、突變體線蟲daf-2（DR1572）、daf-16（CF1038）由線蟲遺傳中心（norhabditis Genetics Center，CGC）提供并保存于本實(shí)驗(yàn)室；胰蛋白胨、瓊脂粉、NaCl、CaCl2、KH2PO4、K2HPO4、MgSO4·7H2O、酵母提取物、膽固醇購自上海薩恩科技有限公司；Trizol 試劑、cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBRGreen 購自南京建成生物工程研究所。

MyCycler 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀、MyiQ2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，美國Bio-Rad 公司；智能恒溫培養(yǎng)箱，寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠；Neofuge 13R 臺式高速冷凍離心機(jī)，力康發(fā)展有限公司；NewClassic MS 電子天平，上海奕宇電子科技有限公司；SMZ-168 顯微鏡，麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司；U-RFLT50 型熒光顯微鏡，日本Olympus 公司。

1.2 秀麗隱桿線蟲同步化

固體培養(yǎng)基（nematode growth media，NGM）配制：稱4.0 g 瓊脂、0.5 g 蛋白胨、0.6 g NaCl 加入195 mL 蒸餾水溶解搖勻。121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min，溫度降至60 ℃左右，加入5 mg/mL 膽固醇乙醇溶液、1 mol/L MgSO4溶液、1 mol/L CaCl2溶液各200 μL，pH6.0 磷酸氫鉀緩沖液5 mL，倒板備用。用M9 緩沖溶液收集生長健康無染的L4 期線蟲到EP 管中，反復(fù)離心清洗3～5 次，棄上清。每管線蟲加入裂解液（0.5 mol/L 氫氧化鈉和2.5%次氯酸），裂解8 min，1 000 r/min，離心2 min，離心機(jī)半徑r=17 cm，棄上清，用M9 反復(fù)清洗5 次，加入M9 在20 ℃恒溫靜置12 h，1 000 r/min，離心1 min，離心機(jī)半徑r=17 cm，棄上清，轉(zhuǎn)移至含有OP50 大腸桿菌的線蟲培養(yǎng)基（nematode growth medium，NGM），20 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，即得同期化L4 期幼蟲。

1.3 壽命測定

首先，使用阿魏酸對大腸桿菌OP50 增殖的影響評估毒性試驗(yàn)，以確定所有實(shí)驗(yàn)均在無毒濃度下進(jìn)行。在20 ℃室溫下，將線蟲在接種有大腸桿菌OP50的NGM（線蟲生長培養(yǎng)基）平板上培養(yǎng)到產(chǎn)卵期，然后使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿溶液處理獲得同步線蟲。將同步化的線蟲，隨機(jī)挑取50 條至加藥組（1、10、50 mmol/L FA）與對照組，此時(shí)記為第0 天，20 ℃下培養(yǎng)，每天同一時(shí)間將線蟲轉(zhuǎn)移至新的同濃度培養(yǎng)皿內(nèi)，并觀察線蟲的存活情況。線蟲死亡及剔除標(biāo)準(zhǔn)：無運(yùn)動(dòng)跡象，用鉑絲輕觸后10 s 無反應(yīng)；線蟲因爬出培養(yǎng)皿失蹤或貼壁致死的不計(jì)入數(shù)據(jù)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，整理數(shù)據(jù)并繪制曲線。使用Graphpad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并計(jì)算Kaplan-Meier壽命和P值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，整理數(shù)據(jù)并作圖。

1.4 抗應(yīng)激實(shí)驗(yàn)

將同期化的野生型N2 線蟲隨機(jī)挑取50 條至加藥組（1、10、50 mg/mL FA）與對照組，預(yù)先培養(yǎng)6 d 后進(jìn)行應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。在熱沖擊實(shí)驗(yàn)中，線蟲暴露于37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行應(yīng)激，每小時(shí)統(tǒng)計(jì)一次壽命，直到所有線蟲死亡為止。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，整理數(shù)據(jù)并作圖。氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)與抗熱應(yīng)激實(shí)驗(yàn)的線蟲培養(yǎng)方法相同，將同期化的野生型N2 線蟲隨機(jī)挑取50條至加藥組（1、10、50 mg/mL FA）與對照組，預(yù)先培養(yǎng)6 d 后進(jìn)行應(yīng)激實(shí)驗(yàn)。在急性氧化應(yīng)激實(shí)驗(yàn)中，線蟲暴露于每10 mL 含10 μL 30 mmol/L 雙氧水的NGM 培養(yǎng)基中，每小時(shí)統(tǒng)計(jì)1 次壽命，直到線蟲全部死亡為止。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，整理數(shù)據(jù)并作圖。

1.5 體長和脂褐素積累分析

將同期化的野生型N2 線蟲隨機(jī)挑取30 條至加藥組（1、10、50 mg/mL FA）與對照組，預(yù)先培養(yǎng)5 d 后，將線蟲放在載玻片滴有1%瓊脂糖墊上，并用NaN3（20μmol/L）麻醉。在熒光顯微鏡下觀察線蟲（激發(fā)波長：340～380 nm；發(fā)射波長：430 nm，10×）。使用Image J 8.5 軟件測量線蟲的熒光強(qiáng)度和體長。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，整理數(shù)據(jù)并作圖。

1.6 產(chǎn)卵實(shí)驗(yàn)

將同步化的L4 期野生型N2 線蟲，隨機(jī)挑取1 條至加藥組與空白對照組，每組10 個(gè)培養(yǎng)皿，此時(shí)記為產(chǎn)卵第1 天，每隔24 h 將線蟲挑至新培養(yǎng)基中，每天記錄蟲卵數(shù)目（產(chǎn)卵量），連續(xù)記錄4 d計(jì)算總產(chǎn)卵量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，整理數(shù)據(jù)并作圖。

1.7 衰老相關(guān)基因測定

使用定量實(shí)時(shí)PCR 確定抗衰老相關(guān)基因的表達(dá)。將同期化線蟲分別在空白和含有不同濃度阿魏酸的NGM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，采用TRIzol從大約1 000 條線蟲中提取總RNA，并采用定量RT 試劑盒提取cDNA。使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測系統(tǒng)，使用SYBR green 對實(shí)時(shí)熒光定量PCR 進(jìn)行評估。引物如表1 所示，act-1作為參考基因，使用2-ΔΔCt法分析比較基因表達(dá)水平。

表1 線蟲抗衰老相關(guān)基因?qū)崟r(shí)定量PCR引物Table 1 Real-time quantitative PCR primers for C.elegans aging-related genes

1.8 DAF-16::GFP 核易位測定

本實(shí)驗(yàn)采用TJ356 突變體線蟲，該品系線蟲特異性標(biāo)記了DAF-16：：GFP（zls356）。將同步化的TJ356 突變體用FA 處理6 d，然后用NaN3（20μmol/L）固定在2%瓊脂糖墊中，然后在熒光顯微鏡下觀察（激發(fā)波長：460～495 nm；發(fā)射波長：510～550 nm，10×）。將DAF-16：：GFP的表達(dá)模式評估為“胞質(zhì)定位”和“核定位”，并計(jì)算DAF-16 蛋白定位在每個(gè)治療組中的百分比。

1.9 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過單因素方差分析（oneway ANOVA）和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（independent-samplesttest）對觀察到的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P＜0.05（雙側(cè)）為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 阿魏酸對線蟲壽命的影響

使用不同濃度的阿魏酸（500μmol/L）和1、10、50、100 mmol/L 對野生型N2 線蟲進(jìn)行處理后，對線蟲壽命的影響示于圖1 和表2。在給予500μmol/L和1、10、50、100 mmol/L阿魏酸后，秀麗隱桿線蟲壽命明顯延長（P＜0.05），且呈濃度依賴趨勢，但阿魏酸在1～50 mmol/L 范圍內(nèi)延壽效果最為明顯，故本研究選取1、10 和50 mmol/L 濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。與對照組相比，給予阿魏酸后線蟲的平均壽命由（12.89±0.2）d 分別增加至（14.49±0.21）、（15.41±0.11）、（17.01±0.13）d，線蟲的壽命分別延長了12.41%、19.55%、31.96%。對4組線蟲壽命檢測比較，經(jīng)單因素方差分析，4 組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=271.482，P＜0.001）；采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)一步作兩兩比較，我們發(fā)現(xiàn)與對照組相比，阿魏酸（1、10、50 mmol/L）處理后的秀麗隱桿線蟲壽命明顯增加（P＜0.001、P＜0.001和P＜0.001；表2，圖1）。

2.2 阿魏酸對線蟲抵抗應(yīng)激能力的影響

圖1 秀麗隱桿線蟲壽命曲線Fig.1 Lifespan curve of C.elegans

表2 阿魏酸對線蟲壽命的影響Table 2 Effects of ferulic acid on lifespan of C.elegans

將秀麗隱桿線蟲暴露于熱應(yīng)激和氧化應(yīng)激環(huán)境下，比較處理組與對照組對壽命的影響。經(jīng)過熱應(yīng)激處理后（圖2A），對照組中線蟲的平均存活時(shí)間為（6.81±0.13）h，而50 mmol/L 阿魏酸處理組的線蟲的平均存活時(shí)間可延長至（8.35±0.43）h。4組線蟲壽命檢測比較，經(jīng)單因素方差分析，4 組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.825，P＝0.005）；采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)一步作兩兩比較，與對照組相比，阿魏酸在10 mmol/L 和50 mmol/L 時(shí)抗熱應(yīng)激力明顯增加（P=0.019，P=0.001）。接下來，我們采用雙氧水急性應(yīng)激實(shí)驗(yàn)來測試阿魏酸的抗氧化能力（圖2B）。結(jié)果顯示，阿魏酸處理組可將線蟲的壽命從（4.16±0.16）h 最高延長到（5.14±0.24）h。同樣，我們使用單因素方差分析對4 個(gè)不同濃度組進(jìn)行壽命比較，與對照組相比，4 組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.571，P＝0.015）；采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)一步作兩兩比較，與對照組相比，阿魏酸在1 mmol/L 時(shí)抗應(yīng)激能力沒有明顯差異（P＞0.05），但在10 mmol/L和50 mmol/L時(shí)抗氧化應(yīng)激力明顯增加（P=0.016，P=0.003）。

2.3 阿魏酸對線蟲體長和脂褐素的影響

圖2 阿魏酸對應(yīng)激抵抗的影響Fig.2 Effectsofferulicacidonstressresistanceof C.elegans

表3 阿魏酸對線蟲應(yīng)激抵抗的影響Table 3 The stress resistance of ferulic acid in C.elegans

接下來，我們比較了不同處理組中線蟲的體型。經(jīng)過單因素方差分析，比較四組的蟲體長度，結(jié)果表明蟲體長度間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F=0.101，P＞0.05；圖3）。接著我們繼續(xù)測量了線蟲的脂褐素積累情況。比較四組的脂褐素積累情況，經(jīng)單因素方差分析，四組間的脂褐素積累差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.752，P＜0.001；圖4）。采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)一步作兩兩比較，10 mmol/L 和50 mmol/L 阿魏酸組線蟲的脂褐素含量比對照組分別降低了13.3%、28.3%（P=0.008、P＜0.001）。

圖3 阿魏酸對線蟲體長的影響Fig.3 Effects of ferulic acid on body length of C.elegans

2.4 阿魏酸對線蟲繁殖力的影響

為證實(shí)該藥物是否會(huì)對線蟲產(chǎn)生副作用，我們進(jìn)行了繁殖力測定。結(jié)果表明，與對照組相比，在分別補(bǔ)充1、10、50 mmol/L 阿魏酸后的線蟲在子代總數(shù)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05；圖5）。這些結(jié)果表明阿魏酸對線蟲的繁殖力沒有明顯副作用。

2.5 衰老相關(guān)基因的表達(dá)

圖4 阿魏酸對線蟲脂褐素的影響Fig.4 Effects of ferulic acid on the lipofuscin accumulation of C.elegans

圖5 阿魏酸對線蟲繁殖力的影響Fig.5 Effects of ferulic acid on the total breeding population of C.elegans

綜合圖1～5 的結(jié)果，阿魏酸可延長線蟲衰老，并且在50 mmol/L 時(shí)效果最佳，但是影響這些作用的機(jī)制尚不清楚。因此，我們選擇了此濃度用于后續(xù)的研究。首先，我們確定了與壽命相關(guān)的基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明，阿魏酸可以明顯影響age-1、daf-2、akt-2、daf-16的表達(dá)（圖6）。對照組的基因表達(dá)定義為1。與對照組相比，在阿魏酸處理后，線蟲體內(nèi)的age-1，daf-2，akt-2的基因表達(dá)量分別下調(diào)至0.79±0.04、0.65±0.16、0.59±0.32（P＜0.001、P=0.002、P=0.033）。同時(shí)，daf-16mRNA 的相對表達(dá)量較空白組相比升高至1.44±0.11（P=0.002）。

2.6 阿魏酸對 daf-2（DR1572）和 daf-16（CF1038）秀麗隱桿線蟲壽命的影響

daf-2和daf-16基因通過胰島素信號通路（IIS）調(diào)控線蟲的應(yīng)激抗性和壽命。我們確定了阿魏酸是否能影響daf-2（DR1572）的突變體daf-16（CF1038）秀麗隱桿線蟲的壽命（圖7，表4）。阿魏酸處理后，daf-2（DR1572）突變體的平均壽命沒有明顯增加（P＞0.05），daf-16（CF1038）秀麗隱桿線蟲的平均壽命也未見明顯延長（P＞0.05）。

圖6 阿魏酸對衰老相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of ferulic acid on expression of senescence related genes

圖7 阿魏酸對突變體線蟲壽命的影響Fig.7 Effect of ferulic acid on the lifespan of mutant Nematodes

2.7 DAF-16核定位

daf-16是胰島素信號通路中主要的轉(zhuǎn)錄因子，可調(diào)節(jié)秀麗隱桿線蟲的壽命和應(yīng)激抵抗性，DAF-16 的核定位對于下游基因的激活至關(guān)重要。因此，我們利用轉(zhuǎn)基因菌株DAF-16：：GFP觀察其核易位并確定了阿魏酸對DAF-16 核定位的影響（圖8）。GFP 信號分為胞質(zhì)定位或核定位。結(jié)果表明，被50 mmol/L 阿魏酸處理后DAF-16：：GFP 在細(xì)胞核定位的線蟲比例從（5.3±1.5）%增加到（28±3）%（P＜0.001）。

表4 阿魏酸對daf-2（DR1572）突變體和daf-16（CF1038）秀麗隱桿線蟲壽命的影響Table 4 Effect of RE on the lifespan of daf-2（DR1572）mutants and daf-16（CF1038）mutants C.elegans

2.8 阿魏酸對daf-16下游基因表達(dá)的影響

以上結(jié)果表明，突變體的壽命與DAF-16 的調(diào)控密切相關(guān)，轉(zhuǎn)錄因子DAF-16 可以調(diào)控下游基因，延長線蟲的壽命。因此，我們確定了daf-16下游基因的表達(dá)水平（sod-3，ctl-2，dod17和clk-1；圖9A）。對照組的基因表達(dá)定義為1。與對照組相比，加藥組的野生型N2 菌株中，sod-3和ctl-2的相對表達(dá)水平上調(diào)至1.69±0.33 和1.38±0.12（P=0.021，P=0.005；圖9A），并且dod17和clk-1相對表達(dá)水平分別下調(diào)至0.46±0.07 和0.74±0.18（P＜0.001，P=0.002；圖9A）。然而，通過比較daf-16（CF1038）秀麗隱桿線蟲中的基因表達(dá)（圖9B），發(fā)現(xiàn)50 mmol/L 阿魏酸處理組與對照組相比，sod-3，ctl-2，dod17和clk-1的mRNA表達(dá)沒有明顯差異（P＞0.05；圖9B）。

3 討論

衰老過程中伴隨著人體免疫功能的下降，生理完整性逐漸喪失，導(dǎo)致功能受損并加劇了許多慢性疾?。?5］。盡管老化是不可逆的過程，但老化速度可以延遲［16］。飲食干預(yù)是一種抗衰老和改善健康的有效非遺傳方法。馬齒莧可以通過胰島素/IGF-1樣信號通路來提高超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性，并且降低活性氧和丙二醛的含量從而增強(qiáng)秀麗隱桿線蟲的抗逆性并延長壽命［17］。忍冬提取物的3 種主要化合物（綠原酸、1，5-二咖啡?？崴岷?，3-二咖啡酰奎尼酸）的組合可顯著延遲由Aβ 毒性引起CL4176 品系秀麗隱桿線蟲的麻痹［18］。藍(lán)莓提取物可以通過在胰島素/IGF 信號傳導(dǎo)途徑和DAF-16 延長線蟲壽命，改善健康指標(biāo)并且增強(qiáng)應(yīng)激抵抗能力［19］。

圖8 阿魏酸對DAF-16核轉(zhuǎn)位的影響Fig.8 Effects of ferulic acid on nuclear translocation of DAF-16

圖9 阿魏酸對DAF-16下游基因的影響Fig.9 Effects of ferulic acid on the downstream genes of DAF-16

阿魏酸是一種常見的多酚化合物，多見于蔬菜，尤其是洋薊、茄子（約占總多酚的90%）和玉米糠（約占總多酚的3.1%）［20］。同時(shí)，它也是一種含有多種生物活性的植物化學(xué)單體，先前已有研究［21］表明阿魏酸在體外具有抗氧化性、抗炎活性以及有助于抵抗神經(jīng)退行性病變，它被認(rèn)為在預(yù)防各類疾病和促進(jìn)健康方面效果顯著。然而，阿魏酸的抗衰老活性及其作用機(jī)制尚未見報(bào)道。在當(dāng)前的研究中，我們采用秀麗隱桿線蟲作為模式動(dòng)物，系統(tǒng)的探究了阿魏酸對線蟲衰老的影響。同空白對照組相比，阿魏酸能夠顯著延長野生型線蟲N2 的壽命。隨著秀麗隱桿線蟲的衰老，它們對外部刺激的抵抗力急劇下降，內(nèi)源性ROS的增加進(jìn)一步加速了衰老過程，形成了惡性循環(huán)。于是我們測試了線蟲的抗應(yīng)激能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿魏酸可明顯提高線蟲在抗氧化應(yīng)激和抗熱應(yīng)激環(huán)境下的壽命，降低來自過氧化氫和熱應(yīng)激所誘導(dǎo)的氧化損傷和熱沖擊。體長和脂褐素都是評估線蟲健康狀況的常用指標(biāo)。壽命的增加通常伴隨著其他生理指標(biāo)的降低。我們發(fā)現(xiàn)阿魏酸能夠明顯減少脂褐素在線蟲中的沉積并且不影響體型的變化。上述實(shí)驗(yàn)證明，阿魏酸可以有效延長線蟲的壽命，提高對環(huán)境的應(yīng)激能力，并降低線蟲脂褐素的積累水平，而對線蟲的體長沒有顯著影響。但是，一些研究人員觀察到壽命的延長可能與生殖力的下降有關(guān)。因此，我們進(jìn)行了繁殖力測定以闡明阿魏酸是否對線蟲有副作用。結(jié)果顯示，阿魏酸對線蟲的繁殖力沒有明顯的副作用。阿魏酸可能不會(huì)影響種系信號導(dǎo)致的生殖細(xì)胞的生育變化，例如精子發(fā)生和卵子生成，也不會(huì)影響其生長速率［22］。同時(shí)不影響線蟲的產(chǎn)卵量和體型，體現(xiàn)出抗衰老作用。胰島素/IGF-1信號傳導(dǎo)（IIS）途徑是調(diào)節(jié)秀麗隱桿線蟲衰老的主要途徑，該途徑從DAF-2 胰島素受體通過AGE-1/PI3K 到AKT-1/2，再到DAF16/FOXO 轉(zhuǎn)錄因子，從而控制線蟲的壽命和相關(guān)代謝［23］。為探究阿魏酸延長秀麗隱桿線蟲是否涉及此條通路，我們首先測定了通路中幾個(gè)主要基因的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在阿魏酸處理后，age-1、daf-2和akt-2基因的mRNA 相對表達(dá)水平分別下調(diào)，且daf-16基因的mRNA相對表達(dá)水平上調(diào)（P=0.002）。此外，通過對通路上兩種基因突變體線蟲daf-2（DR1572）和daf-16（CF1038）的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)阿魏酸處理組與對照組的突變體線蟲的壽命之間沒有顯著差異性，線蟲在缺失daf-2和daf-16基因后，阿魏酸的延壽效果消失。以上結(jié)果表明，阿魏酸可能通過胰島素daf-2/daf-16 延長線蟲壽命。DAF-16 是胰島素信號通路調(diào)控應(yīng)激抵抗和長壽的關(guān)鍵因子，它主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，當(dāng)被磷酸化并激活時(shí)，會(huì)導(dǎo)致其在細(xì)胞核中積累，從而激活其功能以調(diào)節(jié)下游靶基因，例如sod-3、ctl-2、clk-1和dod-17，這幾個(gè)基因在新陳代謝、氧化應(yīng)激和衰老中起著重要作用［24］。我們的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過阿魏酸處理后，促進(jìn)了DAF-16的核定位，并上調(diào)其下游基因sod-3、ctl-2基因的mRNA表達(dá)，同時(shí)下調(diào)dod-17和clk-1基因的mRNA 表達(dá)水平。Song 等［25］研究發(fā)現(xiàn)，激活daf-16基因可促進(jìn)其核定位以及調(diào)節(jié)下游靶基因的表達(dá)，提高應(yīng)激抵抗力并延長壽命與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。

綜上所述，阿魏酸可通過胰島素/IGF-1信號通路和DAF-16 增強(qiáng)線蟲的抗應(yīng)激能力，延長線蟲壽命，改善健康水平。本研究結(jié)果為阿魏酸的研究和開發(fā)進(jìn)一步提供了有力的理論基礎(chǔ)，但壽命調(diào)控機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，有待于繼續(xù)深入探究。