回輸卡介苗激活的T淋巴細(xì)胞重塑裸鼠硬腦膜淋巴管結(jié)構(gòu)

謝毓峰，祁方昉，王清波，王 飛

（1.中山大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510080；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院外科教研室，廣東廣州 510120；3.中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院解剖教研室，廣東廣州 510080；4.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院麻醉科，廣東廣州 510120）

在傳統(tǒng)觀念上，中樞神經(jīng)系統(tǒng)是一個免疫豁免區(qū)域，由于血腦屏障這一天然的物理屏障存在，使得中樞與外周相隔。近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，在硬腦膜內(nèi)存在著淋巴管樣結(jié)構(gòu)［1］，并發(fā)現(xiàn)該結(jié)構(gòu)與外周淋巴結(jié)相聯(lián)通［2］。隨著研究的深入，證明了該結(jié)構(gòu)具有典型的淋巴管道的特征，并且具備引流至頸部淋巴結(jié)的能力［3］。因此，腦膜淋巴管與腦內(nèi)疾病的關(guān)系備受關(guān)注。小鼠腦內(nèi)的代謝產(chǎn)物或有害物質(zhì)積聚在腦內(nèi)引起神經(jīng)炎癥，影響腦脊液循環(huán)，引起神經(jīng)元的損害等，這些可能導(dǎo)致阿爾茨海默癥（Alzheimer’s disease，AD）發(fā)病率增加［4］。淋巴管系統(tǒng)不僅負(fù)責(zé)清除碎屑，而且負(fù)責(zé)組織免疫監(jiān)視的調(diào)節(jié)。在腦膜淋巴管研究中就發(fā)現(xiàn)其中含有大量的T 細(xì)胞，通過消融了淋巴管后，會引起腦實(shí)質(zhì)的灌注受損和腦脊液引流受損，使得腦內(nèi)大分子擴(kuò)散速率減慢，從而影響了空間學(xué)習(xí)和記憶障礙［5］。腦膜淋巴管發(fā)育相關(guān)方面的研究發(fā)現(xiàn)，腦膜淋巴管的發(fā)育依賴于細(xì)胞因子，其中包括血管內(nèi)皮生長因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）等與內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子［6-7］。但外周免疫是如何影響腦膜淋巴管的發(fā)育及淋巴管引流等功能，目前尚未有明確的研究報道。因此，本實(shí)驗(yàn)研究外周免疫缺失下，腦膜淋巴管形態(tài)及功能的變化，為外周免疫系統(tǒng)與中樞系統(tǒng)之間的聯(lián)系提供一定的基礎(chǔ)研究依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物和飼養(yǎng)

8 周齡雌性裸鼠，8 周齡雌性BALB/c 小鼠，均購自廣東省實(shí)驗(yàn)動物中心［實(shí)驗(yàn)動物為SPF 級，許可證號：SYXK（粵）2019-0209］。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于SPF 環(huán)境：溫度（22±2）℃，濕度（55±5）%，12 h 光照和12 h黑暗條件，食物和水自由獲取。本研究所采取的尾靜脈注射均在SPF 環(huán)境內(nèi)進(jìn)行。本研究所有動物實(shí)驗(yàn)操作程序獲得中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會機(jī)構(gòu)審批并通過。

1.2 T細(xì)胞采集及回輸

給BALB/c 小鼠頸背部皮下注射卡介苗，7 日后，取供體小鼠的脾臟，使用RPMI 培養(yǎng)基1640 basic（Life Technologies，北京，中國）加入10 g/L 胎牛血清和抗生素，用注射器栓塞研磨成均質(zhì)單細(xì)胞懸液。用ACK 裂解緩沖液裂解紅細(xì)胞（1X，555899，Biolegend）。脾細(xì)胞洗滌后，用濃度為1×108個細(xì)胞/mL 的分離緩沖液重懸。對CD3+的淋巴細(xì)胞，采用專門為CD3+T 淋巴細(xì)胞設(shè)計(jì)的EasySep T 細(xì)胞分離試劑盒（Stem Cell Technologies），通過陰性選擇進(jìn)一步分離T 淋巴細(xì)胞。本研究中，通過尾靜脈注射用1×107個單核T 淋巴細(xì)胞重建每只裸鼠，總體積為200μL。

1.3 免疫熒光染色法

小鼠按10 mL/kg 經(jīng)腹腔注射40 g/L 水合氯醛過量麻醉。剪開頸部皮膚，用眼科鑷分離出頸部淋巴結(jié)，放 入40 g/L 多 聚 甲 醛（paraformaldehyde，PFA）的固定液4 ℃固定24 h，梯度脫水后行連續(xù)冰凍切片（厚度20μm）。取完頸部淋巴結(jié)后，用預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer，PBS）心臟灌注，去除小鼠外周血，剪去頸后肌肉，將顱骨從枕骨大孔剪至上顎，用手術(shù)剪去除顱骨周圍多余的骨組織，用眼科鑷將腦組織從顱骨內(nèi)剝離，將顱骨連帶硬腦膜一起放入20 g/L 多聚甲醛4 ℃固定，不超過24 h［8］，PBS 漂洗一遍后在體視顯微鏡下，用眼科鑷將硬腦膜從顱骨內(nèi)輕輕剝離。

CD11b+/Lyve-1+雙標(biāo)染色：將硬腦膜經(jīng)PBS 洗后，用含2 g/L Triton X-100 牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA）于37 ℃孵育30 min，加入一抗：大鼠抗-CD11b（1：500）、羊抗-Lyve-1（1：500）于37 ℃孵育2 h后4 ℃過夜，次日用PBS漂洗3次后加入二抗：Alexa Flour 594 驢抗大鼠-IgG（1：500）、Alexa Flour 488 驢抗羊-IgG（1：500），于37 ℃孵育2 h，PBS 漂洗3 次后，用熒光封片劑（0.01 mmol/L PBS和甘油1：1配比）封片。

封片完畢后于激光共聚焦顯微鏡（ZEISS780）下掃描拍照。應(yīng)用Image J圖像分析軟件對CD11b+的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，應(yīng)用Image J 圖像分析計(jì)算出腦膜內(nèi)淋巴管上皮細(xì)胞lyve-1+熒光強(qiáng)度（AU）；并以BALB/C 組為基準(zhǔn)，比較各組腦膜內(nèi)淋巴管上皮細(xì)胞lyve-1+熒光強(qiáng)度。應(yīng)用Image J 計(jì)算淋巴結(jié)內(nèi)lyve-1+細(xì)胞占圖中整個面積的百分比（ROI）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差或中位數(shù)（四分位數(shù)間距）表示。裸鼠和BALB/c 小鼠背側(cè)淋巴管內(nèi)CD11b+的細(xì)胞數(shù)量，采用Student’sttest 雙側(cè)t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)的檢測方法分析數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，以P＜0.05 為顯著性水準(zhǔn)。其余數(shù)據(jù)僅作定性分析。

2 結(jié)果

2.1 外周免疫缺失促進(jìn)CD11b+細(xì)胞進(jìn)入腦膜淋巴管

在8 周齡的裸鼠和BALB/c 小鼠的腦膜淋巴管中發(fā)現(xiàn)，在背側(cè)矢狀竇處淋巴管中，裸鼠CD11b+細(xì)胞的數(shù)量少于BALB/c 小鼠，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［53.2（39.9～66.5）vs.29.0（22.2～35.8），n=3，t=3.598，P=0.007；圖1A、B、E］；但在乙狀竇處的淋巴管內(nèi)觀察到裸鼠CD11b+細(xì)胞的數(shù)量多于BALB/c小鼠（圖1C、D）；其原因可能是BALB/c 小鼠腦膜淋巴管的引流功能正常，在背側(cè)擔(dān)任傳遞功能的細(xì)胞多，在乙狀竇部，淋巴管的結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞遷入較少，而裸鼠因?yàn)榱馨凸馨l(fā)育異常，淋巴管結(jié)構(gòu)不全，導(dǎo)致淋巴管引流功能降低，細(xì)胞較易穿過管壁進(jìn)入淋巴管。

2.2 回輸BCG誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞有助于腦膜淋巴管發(fā)育

過繼轉(zhuǎn)移T 淋巴細(xì)胞14 d 后，在背側(cè)處的硬腦膜，與未處理的裸鼠（圖2B，91.56 AU）相比，回輸T淋巴細(xì)胞的裸鼠腦內(nèi)的淋巴管上皮細(xì)胞lyve-1 的表達(dá)量增加，促進(jìn)腦膜淋巴管的結(jié)構(gòu)發(fā)育完整，對腦膜淋巴管有正向促進(jìn)作用（圖2D，121.71 AU），與正常小鼠（圖2A，255.00 AU）比較，腦膜淋巴管結(jié)構(gòu)仍有欠缺，但結(jié)果好于注射PBS（圖2C，87.08 AU）的小鼠。結(jié)果顯示，外周免疫細(xì)胞或其所分泌的細(xì)胞因子可能對中樞內(nèi)的淋巴樣管道的發(fā)育起到一定的影響。在乙狀竇處的硬腦膜，可得到相同的結(jié)果。（圖2E，255.00 AU；F，76.73 AU；G，58.04 AU；H，89.09 AU）。定性比較，我們認(rèn)為回輸BCG誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞有助于腦膜淋巴管的發(fā)育。

圖1 裸鼠淋巴管內(nèi)呈遞細(xì)胞分布異常Fig.1 Abnormal distribution of CD11b+cells in meningeal lymphatic vessels in nude mice

圖2 回輸激活T細(xì)胞促進(jìn)裸鼠腦膜淋巴管增殖Fig.2 Retransfusion activated T cells promoted proliferation of meningeal lymphatic vessels in nude mice

2.3 裸鼠頸淺淋巴結(jié)內(nèi)淋巴小結(jié)增生

對裸鼠和BALB/c 小鼠的頸部淺淋巴結(jié)進(jìn)行l(wèi)yve-1 淋巴管特異染色發(fā)現(xiàn)，裸鼠的淋巴結(jié)皮質(zhì)部分的淋巴管結(jié)構(gòu)（圖3C，ROI=14.11%）與BALB/c 小鼠（圖3A，ROI=13.05%）無明顯差異。在副皮質(zhì)區(qū)，裸鼠淋巴結(jié)內(nèi)淋巴管（圖3D，ROI=16.36%）與BALB/c 小鼠（圖3B，ROI=16.04%）也無明顯差異，但在裸鼠了淋巴結(jié)內(nèi)可以見到較多被淋巴管劃分的類似淋巴結(jié)的區(qū)域。

3 討論

在正常的腦膜淋巴管內(nèi)，不同部位的腦膜淋巴管擔(dān)當(dāng)著不同的功能，基底部淋巴管呈紐扣狀閉合，易于細(xì)胞遷入和物質(zhì)交換；背側(cè)淋巴管呈鏈狀連續(xù)閉合，起到引流的作用［7］。包括阿爾茨海默癥［4］，多發(fā)性脊髓硬化癥［9］在內(nèi)的神經(jīng)炎癥與腦膜淋巴管引流功能異常相關(guān)。腦膜淋巴管的引流功能以及與引流功能相關(guān)的因素，如年齡［10］、淋巴管的位置［5］等都已被前人研究，并且對引流途徑有了較為詳細(xì)的論述。文獻(xiàn)報道，正常腦膜淋巴管同腦動靜脈一起發(fā)育，且與細(xì)胞因子相關(guān)［11］。我們既往研究［12］表明，向裸鼠過繼卡介苗激活的T 淋巴細(xì)胞后，促進(jìn)小鼠海馬細(xì)胞的增殖和行為改變。發(fā)現(xiàn)卡介苗誘導(dǎo)外周免疫激活后，對硬腦膜和腦膜巨噬細(xì)胞的極化和募集增加［13］。根據(jù)我們既往研究［14］發(fā)現(xiàn)，注射卡介苗后，小鼠體內(nèi)的抗炎細(xì)胞因子IL-10表達(dá)量會增加，尤其是腦膜內(nèi)的CD11b+細(xì)胞表達(dá)量為著，同時，還發(fā)現(xiàn)，被卡介苗所誘導(dǎo)的單核細(xì)胞所衍生的巨噬細(xì)胞，其募集部位多位于脈絡(luò)叢和血管周圍間隙，并且腦膜內(nèi)的巨噬細(xì)胞激活需要相應(yīng)的T 細(xì)胞募集至脈絡(luò)叢內(nèi)，在卡介苗的誘導(dǎo)下，我們發(fā)現(xiàn)了T細(xì)胞在腦膜內(nèi)的浸潤［15］。

在此基礎(chǔ)上，推測此次實(shí)驗(yàn)的裸鼠可能由于缺乏T 細(xì)胞，導(dǎo)致其腦膜內(nèi)的巨噬細(xì)胞的激活缺乏相應(yīng)的T 細(xì)胞的誘導(dǎo)，從而表現(xiàn)在橫竇和乙狀竇內(nèi)的CD11b+細(xì)胞數(shù)量明顯減少。由此信息，進(jìn)一步推測外周免疫與中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在聯(lián)系；但目前尚未有明確的研究表明中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周免疫系統(tǒng)之間的媒介是循環(huán)系統(tǒng)或者是腦膜淋巴管。研究［8］報道，腦脊液是從腦膜淋巴管引流至頸部淋巴結(jié)，從而對腦脊液內(nèi)的物質(zhì)進(jìn)行清理。因此，該區(qū)域增生的淋巴結(jié)，也可能是位于擔(dān)任細(xì)胞免疫的副皮質(zhì)區(qū)，且增生數(shù)量較野生型組的淋巴結(jié)多。也可能是由于胸腺的缺失導(dǎo)致T 細(xì)胞的發(fā)育缺失，引起數(shù)量上的增加來補(bǔ)償細(xì)胞功能上的不足。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：外周免疫缺陷的小鼠腦內(nèi)淋巴管的發(fā)育情況較正常小鼠降低，淋巴管的引流功能可能存在差異，且淋巴管的功能可能與頸部淋巴結(jié)相關(guān)聯(lián)。再次激活外周免疫，可促進(jìn)腦膜淋巴管的發(fā)育。本研究的發(fā)現(xiàn)揭示了外周免疫影響腦膜淋巴管的發(fā)育，提示外周免疫調(diào)節(jié)可能對改善中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥有一定的作用。

圖3 免疫缺陷導(dǎo)致頸部淋巴結(jié)副皮質(zhì)區(qū)淋巴管增殖抑制Fig.3 Immunodeficiency leads to inhibition of lymphatic vessels proliferation in the paracortical area of cervical lymph node

近年來，隨著腦膜淋巴管的發(fā)現(xiàn)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)與外周免疫的聯(lián)系受到廣泛的關(guān)注。外周的免疫調(diào)節(jié)參與改善大腦的功能和行為［12］，在炎癥狀態(tài)下，篩板內(nèi)的CD11b+細(xì)胞表達(dá)VEGFC，可促進(jìn)VEGFR3 依賴性淋巴管的生成，該淋巴管生成在功能上增加了腦源性抗原進(jìn)入引流淋巴管的通道，促進(jìn)引流多余的液體。同時，淋巴管也表達(dá)CCL21，與樹突狀細(xì)胞的遷移有相關(guān)性［16］。也有研究表明，CCL21-CCR7 途徑與淋巴系統(tǒng)內(nèi)T 細(xì)胞的引流相關(guān)，而腦膜淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞和頸部淋巴結(jié)內(nèi)皮細(xì)胞都表達(dá)CCR7 相關(guān)的配體CCL21，相關(guān)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了免疫細(xì)胞在淋巴管內(nèi)運(yùn)輸與該途徑有密切聯(lián)系［17］。同時，也有研究報道，外周淋巴結(jié)與外周的神經(jīng)系統(tǒng)存在相互作用，巨噬細(xì)胞在小鼠淋巴結(jié)旁皮質(zhì)和延髓內(nèi)表現(xiàn)出與神經(jīng)纖維緊密并列的位置，可與神經(jīng)纖維產(chǎn)生雙向相互作用［18］，淋巴管存在神經(jīng)支配。我們推測，中樞神經(jīng)系統(tǒng)與腦膜淋巴管及其相鄰的頸部淋巴結(jié)也可能存在這類相互作用。

也有研究［7］表明，隨著年齡的增長，腦膜淋巴管的水腫和淋巴管內(nèi)瓣膜的消失使腦脊液清除率減低，可能導(dǎo)致AD 的發(fā)生。我們也進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同月齡AD 小鼠的腦膜內(nèi)，CD11b+的細(xì)胞數(shù)量顯著低于對照組，因此，推測淋巴管內(nèi)的免疫相關(guān)細(xì)胞的減少可能也是其功能減退的原因之一。誠然，這一推斷仍需進(jìn)一步地實(shí)驗(yàn)加以證實(shí)。

綜上所述，本文通過對不同外周免疫情況的小鼠進(jìn)行對比，證明了外周免疫缺失影響腦膜淋巴管的發(fā)育，除了觀察到淋巴管特征性表達(dá)降低，還可觀察到淋巴管內(nèi)免疫細(xì)胞數(shù)量在背側(cè)矢狀竇的數(shù)量降低和乙狀竇內(nèi)存在細(xì)胞遷入的可能。本研究初次探討了頸部淋巴結(jié)的功能異?？赡苡绊懩X膜淋巴管的功能，提示外周免疫調(diào)節(jié)可能通過改善腦膜淋巴管的結(jié)構(gòu)和功能來影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)。