膝骨關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞CD36表達(dá)與氧化應(yīng)激的相關(guān)性研究

周巧 劉健 宋倩 郭錦晨 黃旦

【摘 要】目的：探討B(tài)類清道夫受體白細(xì)胞分化抗原36（CD36）在膝骨關(guān)節(jié)炎患者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）上的表達(dá)及臨床意義，以闡明其在膝骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生和發(fā)展中的作用。方法：應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)70例膝骨關(guān)節(jié)炎患者和30例健康對(duì)照者PBMC表面CD36相對(duì)熒光強(qiáng)度，比較2組的表達(dá)情況，采用ELISA法檢測(cè)2組炎性細(xì)胞因子、氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)，并分析其相關(guān)性。結(jié)果：膝骨關(guān)節(jié)炎患者PBMC上CD36相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著高于正常對(duì)照組（P < 0.01）。與正常對(duì)照組比較，膝骨關(guān)節(jié)炎組超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（TAOC）、白細(xì)胞介素（IL）-4、IL-9明顯降低，丙二醛（MDA）、脂質(zhì)過氧化物、IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）水平升高（P < 0.05或P < 0.01）。膝骨關(guān)節(jié)炎患者PBMC上CD36表達(dá)與SOD（r = -0.296，P = 0.014）、TAOC（r = -0.241，P = 0.042）呈負(fù)相關(guān)，與MDA（r = 0.255，P = 0.029）呈正相關(guān);與炎性細(xì)胞因子IL-1β（r = 0.307，P = 0.009）、IL-6（r = 0.285，P = 0.017）、TNF-α（r = 0.265，P = 0.025）呈正相關(guān)。結(jié)論：膝骨關(guān)節(jié)炎患者PBMC上CD36表達(dá)異常，與炎癥反應(yīng)和氧化損傷有明確的相關(guān)性。

【關(guān)鍵詞】 膝骨關(guān)節(jié)炎;外周血單個(gè)核細(xì)胞;B類清道夫受體白細(xì)胞分化抗原36;氧化應(yīng)激

Correlation between the Expression of CD36 in Peripheral Blood Mononuclear Cells and Oxidative Stress in Patients with Knee Osteoarthritis

ZHOU Qiao，LIU Jian，SONG Qian，GUO Jin-chen，HUANG Dan

【ABSTRACT】Objective：To investigate the expression and clinical significance of CD36 in peripheral blood mononuclear cells（PBMC）of patients with knee osteoarthritis（KOA）.Methods：Flow cytometry was used to detect the relative fluorescence intensity of CD36 on the surface of PBMC in 70 patients with knee osteoarthritis and 30 healthy controls.The expression of cytokines and oxidative stress related indicators in the two groups were detected by ELISA，and the correlation between them was analyzed.Results：The relative fluorescence intensity of CD36 on PBMC of patients with knee osteoarthritis was significantly higher than that of the normal group（P < 0.01）.Compared with the normal group，the levels of SOD，TAOC and IL-4 were significantly decreased，and the levels of MDA，IL-1β，IL-6 and TNF-α were increased in the knee osteoarthritis group（P < 0.05 or P < 0.01）.

CD36 expression was negatively correlated with SOD（r = -0.296，P = 0.014），TAOC（r = -0.241，P = 0.042），positively correlated with MDA（r = 0.255，P = 0.029），and positively correlated with IL-1β（r = 0.307，P = 0.009），IL-6（r = 0.285，P = 0.017）and TNF-α（r = 0.265，P = 0.025）.Conclusion：

The abnormal expression of CD36 in PBMC of patients with knee osteoarthritis has a clear correlation with inflammatory reaction and oxidative damage.

【Keywords】 knee osteoarthritis;peripheral blood mononuclear cells;CD36;oxidative stress

骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）的特征是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的逐漸破壞，膝關(guān)節(jié)是最常受累部位，稱為膝骨關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）。軟骨細(xì)胞衰老已被認(rèn)為是影響軟骨穩(wěn)態(tài)和功能衰老相關(guān)變化的主要因素，并且與炎癥介質(zhì)的增加和氧化應(yīng)激有關(guān)[1]。異常升高的活性氧（ROS）會(huì)破壞細(xì)胞成分，例如細(xì)胞膜中的脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、線粒體和核酸，干擾軟骨細(xì)胞的無(wú)氧代謝和軟骨破壞[2]。B類清道夫受體白細(xì)胞分化抗原36（CD36）是一種廣泛表達(dá)的模式識(shí)別受體，可作為多種配體的清除劑受體，促進(jìn)其攝取和細(xì)胞內(nèi)降解[3]。巨噬細(xì)胞、血小板和某些其他細(xì)胞類型的CD36表達(dá)誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)[4]，CD36是促炎和氧化途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[5]。CD36信號(hào)可下調(diào)關(guān)鍵的抗氧化因子，但其具體的作用途徑及機(jī)制尚未闡明。

本研究通過檢測(cè)KOA患者及健康對(duì)照者外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）中CD36的表達(dá)，分析其與氧化應(yīng)激指標(biāo)、細(xì)胞因子的相關(guān)性，探討其在KOA發(fā)生和發(fā)展中的作用。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2017年7月至2018年7月在安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科就診的住院KOA患者70例，男25例，女45例;年齡37～70歲，平均（55.43±7.53）歲;病程1～14年，平均（6.89±5.72）年;體質(zhì)量47～86 kg，平均（62.07±11.18）kg。同時(shí)選取安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院健康體檢中心人員30例為正常對(duì)照組，男10例，女20例;年齡44～69歲，平均（57.23±8.50）歲;體質(zhì)量45～78 kg，平均（60.23±12.14）kg。正常對(duì)照組均為身體健康、無(wú)明顯器質(zhì)性疾病者，性別、年齡與KOA組匹配。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 按照2010年中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)發(fā)布的《骨關(guān)節(jié)炎診斷及治療指南》[6]標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ①KOA患者符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，X線檢查根據(jù)Kellgren-Lawrence[7]標(biāo)準(zhǔn)符合Ⅰ～Ⅲ級(jí);②年齡35～75歲。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①合并有心腦血管、肝、腎和造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病者;②精神病患者;③重度KOA患者;④其他種類膝關(guān)節(jié)炎患者，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等。

2 方 法

2.1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PBMC上CD36的表達(dá) 用肝素鈉管清晨空腹抽取靜脈血，100 μL全血入流式管，先后加入5 μL異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的CD36抗體和CD14-藻紅蛋白（PE）。放置15 min后，加入2 mL溶解反應(yīng)物裂解紅細(xì)胞。將混濁液置于離心機(jī)以1500 r·min-1離心5 min，離心半徑10 cm，棄上清。放置10 min后，使裂解細(xì)胞沉淀、分離。分離后的液體用2 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗，再次以1500 r·min-1離心5 min，離心半徑10 cm，然后加入0.5 mL的PBS再次洗滌。采用Fabcaliar流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，以CD14-PE為縱坐標(biāo)，CD36-FITC為橫坐標(biāo)的散點(diǎn)圖上圈定單核細(xì)胞群并設(shè)門，然后分析門內(nèi)FITC和PE雙陽(yáng)性細(xì)胞單核細(xì)胞CD36表達(dá)的相對(duì)熒光強(qiáng)度，采用Kaluza軟件進(jìn)行分析。

2.2 ELISA法檢測(cè)白細(xì)胞介素（IL）-1β、IL-4、IL-6、IL-10、IL-9、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β）、過氧化脂質(zhì)（LPO）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（TAOC）的表達(dá) 抽取2組靜脈血

3 mL，4℃至自然凝固后置于離心機(jī)以3000 r·min-1離心5 min，離心半徑10 cm，分離血清。分為以下步驟：①稀釋與加樣;②溫育;③配液;④洗滌;⑤加酶，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μL，空白孔除外，重復(fù)上述溫育和洗滌過程;⑥顯色，每孔先后加入顯色劑A 50 μL和B 50 μL，輕混勻避光顯色15 min。終止反應(yīng)后，以450 nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn);不符合正態(tài)分布采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn);相關(guān)性分析采用Spearman分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 KOA組和正常對(duì)照組PBMC上CD36相對(duì)熒光強(qiáng)度表達(dá)情況 KOA組PBMC上CD36相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著高于正常對(duì)照組，平均相對(duì)熒光強(qiáng)度分別為（36.65±2.71）和（15.89±2.13），2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。實(shí)驗(yàn)相關(guān)流程見圖1至圖5。

3.2 KOA組和正常對(duì)照組細(xì)胞因子和氧化應(yīng)激指標(biāo)的表達(dá)情況 與正常對(duì)照組比較，KOA組SOD、TAOC明顯降低，MDA、LPO水平明顯升高

（P < 0.05或P < 0.01）;KOA組IL-4、IL-9明顯降低，IL-1β、IL-6、TNF-α明顯升高（P < 0.05或P < 0.01）。2組TGF-β比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ﹥ 0.05）。見表1。

3.3 KOA患者PBMC上CD36表達(dá)水平與氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子的相關(guān)性分析 PBMC上CD36與氧化應(yīng)激指標(biāo)相關(guān)性分析結(jié)果表明，CD36與SOD、TAOC呈負(fù)相關(guān)，與MDA、LPO呈正相關(guān);與細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α呈正相關(guān)，與IL-4、IL-9、TGF-β呈負(fù)相關(guān)。見表2。

4 討 論

OA是一種以關(guān)節(jié)軟骨病變?yōu)樘卣鞯娘L(fēng)濕病。軟骨細(xì)胞是軟骨中的主要細(xì)胞群，它們?cè)谲浌谴x的穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用。當(dāng)軟骨細(xì)胞的抗氧化能力和自噬水平降低時(shí)，就會(huì)發(fā)生氧化應(yīng)激，破壞軟骨的穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致OA的發(fā)生和發(fā)展。當(dāng)軟骨細(xì)胞暴露于ROS中，可以誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞氧化應(yīng)激[8]。氧化應(yīng)激的存在會(huì)導(dǎo)致OA軟骨中端粒基因組不穩(wěn)定，軟骨細(xì)胞復(fù)制性衰老和功能障礙，這表明氧化應(yīng)激致使軟骨細(xì)胞衰老可能是導(dǎo)致OA發(fā)病的重要機(jī)制。深入研究減少關(guān)節(jié)軟骨氧化損傷的作用靶點(diǎn)，可以為防治KOA提供思路[9]。本研究也表明，KOA患者中SOD、TAOC下降，MDA、LPO升高，表明KOA患者體內(nèi)存在氧化損傷，這些氧化損傷可能是導(dǎo)致軟骨細(xì)胞衰老和軟骨老化的原因。SOD是抗氧化系統(tǒng)中一種必不可少的酶，通過減少超氧化物自由基而在保護(hù)氧化應(yīng)激的機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TAOC是一個(gè)綜合性指標(biāo)，用于衡量機(jī)體抗氧化系統(tǒng)功能狀況，其大小可代表和反映機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)和非酶促系統(tǒng)對(duì)外來(lái)刺激的代償能力以及機(jī)體自由基代謝的狀

態(tài)[10]。MDA、LPO是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物。自由基的增加會(huì)導(dǎo)致MDA的過量產(chǎn)生，是組織細(xì)胞損傷的重要標(biāo)志[11]。KOA患者中抑炎因子IL-4、IL-9表達(dá)明顯下降，促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平明顯升高。研究表明，氧化損傷可以誘發(fā)炎癥機(jī)制的激活，誘導(dǎo)OA中軟骨細(xì)胞的凋亡[12]。

CD36是一種跨膜清道夫受體，已知有多種表達(dá)細(xì)胞類型，如巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、脂肪細(xì)胞和上皮細(xì)胞。CD36是巨噬細(xì)胞表面主要的識(shí)別、內(nèi)吞氧化低密度脂蛋白的清道夫受體，可在氧化應(yīng)激條件下促進(jìn)慢性炎癥。在一定條件下，CD36生成特定的反應(yīng)性氧化劑，具體取決于環(huán)境和細(xì)胞。在脈管系統(tǒng)中，平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中的CD36信號(hào)會(huì)促進(jìn)ROS的生成、抗氧化劑基因的遺傳下調(diào)，并損害平滑肌和內(nèi)皮功能[13]。CECIL等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在兩種嚙齒動(dòng)物KOA模型中，CD36表達(dá)相對(duì)增加，可能導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨再生缺陷。模式識(shí)別受體CD36認(rèn)為是軟骨細(xì)胞肥大標(biāo)志物，并與抑制分解代謝反應(yīng)和導(dǎo)致軟骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)有關(guān)。在重度OA患者軟骨中，CD36免疫染色的軟骨細(xì)胞數(shù)量顯著增加。CD36通過激活促炎和氧化途徑促進(jìn)腎纖維化[15]。原兒茶酸通過CD36/AMPK通路激活Sirt1和Sirt3恢復(fù)錳依賴性SOD的活性，改善內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激，發(fā)揮抗氧化活性[16]。

本研究流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果提示，KOA患者PBMC上CD36表達(dá)異常增高。將CD36與氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子指標(biāo)的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，CD36與SOD、TAOC呈負(fù)相關(guān)，與MDA、LPO呈正相關(guān);與細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α呈正相關(guān)，與IL-4、IL-9、TGF-β呈負(fù)相關(guān)。表明CD36的表達(dá)與氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，共同參與KOA的發(fā)生和發(fā)展，但其作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。炎癥已被證明直接觸發(fā)軟骨細(xì)胞的分解代謝活動(dòng)，最終導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解。IL-1β、IL-6和TNF-α等炎性細(xì)胞因子的過度產(chǎn)生在OA病理發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。IL-1β已被證明在軟骨基質(zhì)降解中起關(guān)鍵作用，在OA患者的滑液和軟骨組織中高水平表達(dá)[17]。IL-1β還通過誘導(dǎo)環(huán)氧合酶2

（COX-2）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的釋放發(fā)揮其炎癥作用[18]。IL-6也通過觸發(fā)一系列軟骨損傷事件，例如誘導(dǎo)基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）、COX-2、前列腺素E2（PGE2）和一氧化氮的產(chǎn)生，在OA發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用。TNF-α和IL-1β之間有協(xié)同作用，誘發(fā)關(guān)節(jié)組織中的炎癥和分解代謝[19]。IL-1β和TNF-α誘導(dǎo)iNOS、COX-2和PGE2合酶的產(chǎn)生，從而增加其產(chǎn)物的量，誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激產(chǎn)生。IL-4在軟骨代謝過程中起重要的軟骨保護(hù)作用，IL-4通過抑制MMPs的分泌以及減少蛋白聚糖的生成對(duì)關(guān)節(jié)軟骨有保護(hù)作用[20]。IL-9是重要的合成性細(xì)胞因子[21]。TGF-β可抑制IL-1β、TNF-α、MMP-9、MMP-13的基因表達(dá)，進(jìn)而阻止軟骨Ⅱ型膠原的過度降解[22]。

綜上所述，KOA患者PBMC表面的CD36相對(duì)熒光強(qiáng)度異常升高，且其表達(dá)與氧化應(yīng)激、細(xì)胞因子相關(guān)，提示CD36的重要性。本文初步證實(shí)了PBMC表面的CD36異常表達(dá)可能加劇氧化損傷或炎癥反應(yīng)導(dǎo)致KOA軟骨細(xì)胞的凋亡，但相關(guān)機(jī)制研究甚少。深入研究CD36對(duì)KOA患者軟骨細(xì)胞調(diào)節(jié)的影響，為闡明KOA患者細(xì)胞-氧化調(diào)節(jié)機(jī)制及臨床治療提供新思路。CD36作為預(yù)防和治療KOA的潛在靶點(diǎn)，研發(fā)針對(duì)CD36的抗體和藥物可能存在潛在的臨床意義。

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收稿日期：2020-11-08;修回日期：2020-12-24