酥瓜果實(shí)細(xì)菌性斑點(diǎn)病的病原鑒定

程勛輝, 張立新, 王晶晶, 宋江華*

酥瓜果實(shí)細(xì)菌性斑點(diǎn)病的病原鑒定

程勛輝1, 張立新2, 王晶晶3, 宋江華1*

(1. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 合肥 230036；2. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 合肥 230036；3. 淮南市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所 淮南 232008)

為明確安徽省淮南市地區(qū)酥瓜果實(shí)斑點(diǎn)病的病原菌，采用常規(guī)平板劃線法從酥瓜果實(shí)病組織分離細(xì)菌，通過生理生化特征、分子生物學(xué)特性和致病性試驗(yàn)對其進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，從采集的病果中獲得36株菌落形態(tài)特征相似的細(xì)菌分離物，測試菌株均能誘導(dǎo)煙草葉片產(chǎn)生過敏性壞死。采用牙簽刺傷法將測試菌株接種健康酥瓜果實(shí)，可導(dǎo)致接種點(diǎn)處產(chǎn)生水浸狀病斑。BLAST結(jié)果表明，2株菌株的16S rRNA序列分別與短小芽胞桿菌GR-8 （CP009108），ATCC 7061（ABRX01000003）的同源性為99.93%和99.58%，2株菌株的基因序列與C4（CP011109）的同源性達(dá)99.39%?；诨虻木垲惙治鲎C實(shí)2株菌株與（C4和GR-8）緊密的聚在一個分支。生理生化試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步顯示，該細(xì)菌與文獻(xiàn)報道的短小芽胞桿菌的生理生化特征相吻合。結(jié)合細(xì)菌生理生化特征、16S rRNA和基因的序列分析，以及柯赫氏法則驗(yàn)證，確定引起酥瓜果實(shí)細(xì)菌性斑點(diǎn)病的病原為。

酥瓜；果實(shí)斑點(diǎn)??；鑒定；短小芽胞桿菌

酥瓜（var.Group），別名羊角酥、脆瓜等，是葫蘆科甜瓜屬甜瓜種的變種。瓜呈羊角形，瓜皮白綠色，瓜肉綠色，瓜瓤桔紅色，皮薄、味甜、富含多種維生素，營養(yǎng)價值很高[1-2]。該作物在我國安徽、山東、四川和河南等地均有廣泛種植，類型和品種多樣。近年來，隨著甜瓜種植面積的推廣，耕作模式的調(diào)整和氣候變化的影響，甜瓜病害種類的發(fā)生呈現(xiàn)出多樣性和嚴(yán)重趨勢。瓜類細(xì)菌性果斑病是葫蘆科植物上的一種嚴(yán)重的世界性病害，該病害主要侵染西瓜、甜瓜和黃瓜等，為害瓜類植株的真葉、莖蔓和果實(shí)[3-4]。在瓜類果實(shí)上的病斑初為水浸狀，圓形或卵圓形，綠褐色；后期擴(kuò)展成大病斑，顏色變深呈褐色至黑褐色，嚴(yán)重時內(nèi)部組織腐爛[4]。前人研究將引起該病害的病原鑒定為燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N（subsp.）[5-6]，后來將該細(xì)菌命名為西瓜噬酸菌（）[7]。

2016和2017年，在淮南酥瓜主要生產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)了一種新的細(xì)菌性果實(shí)斑點(diǎn)病。病害發(fā)生時，酥瓜果實(shí)表面密集分布水浸狀斑點(diǎn)，表皮內(nèi)層組織感染后呈水浸狀腐爛，病害癥狀與先前報道的由西瓜噬酸菌引起的瓜類果斑病的癥狀很相似。該病害在淮南的酥瓜局部種植田塊普遍發(fā)生，病果發(fā)生率達(dá)到10%以上，嚴(yán)重影響了酥瓜的經(jīng)濟(jì)價值。為弄清安徽淮南地區(qū)酥瓜果實(shí)斑點(diǎn)病的病原，本研究采用平板劃線分離法獲得酥瓜果實(shí)斑點(diǎn)病的病原菌菌株，并利用生理生化試驗(yàn)、柯赫氏法則驗(yàn)證，以及16S rRNA和基因序列分析對該病原菌進(jìn)行鑒定，以期為該病害的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病樣采集與細(xì)菌分離

1.1.1 病樣采集 病害樣品采集自淮南潘集區(qū)酥瓜主要種植區(qū)，選取典型病害樣本，描述癥狀及拍照。

1.1.2 細(xì)菌分離 選取不同田塊收集的發(fā)病酥瓜果實(shí)，在無菌操作臺內(nèi)用滅菌脫脂棉蘸取75%乙醇擦拭病果發(fā)病部位3～5次，然后用滅菌刀片輕輕刮去發(fā)病的表皮組織，取下層腐爛果肉組織置入約5 mL無菌水中，然后搗碎病組織、制成帶菌的病組織懸浮液，靜置10 min。用無菌接種環(huán)蘸取病組織懸浮液接種于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA）上，采用平板劃線法進(jìn)行細(xì)菌分離，然后將平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h，待細(xì)菌菌落長出后，挑取單菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，并將純化的細(xì)菌培養(yǎng)物保存于試管斜面和30%甘油中待用。

1.2 煙草過敏性壞死反應(yīng)

將分離細(xì)菌在NA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)48 h，用無菌水配制濃度為108CFU·mL-1的細(xì)菌懸浮液，用無菌注射器將細(xì)菌懸浮液從煙葉（中煙100）下表皮注入葉肉細(xì)胞間。接種后將煙草植株置于人工氣候箱培養(yǎng)24～48 h，培養(yǎng)條件為溫度28 ℃，相對濕度85%，12 h黑暗光照交替。觀察測試菌株是否能引起煙草過敏性壞死反應(yīng)，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 致病性測定

將分離細(xì)菌配制成細(xì)菌懸浮液（方法同1.2）。選取健康酥瓜（品種：綠美人，淮南市農(nóng)科所選育），果實(shí)表面用滅菌棉花蘸取75%乙醇擦拭消毒、晾干。用滅菌牙簽蘸取測試菌株的細(xì)菌懸浮液、刺傷接種酥瓜果實(shí)，刺入深度約0.5 cm；同時用滅菌牙簽蘸取無菌水刺傷接種酥瓜果實(shí)作為陰性對照。將接種后的酥瓜分別裝入保鮮袋內(nèi)，然后置入28℃恒溫氣候箱中，培養(yǎng)48 h后去除保鮮袋，并逐日觀察記錄酥瓜果實(shí)發(fā)病情況。

1.4 病原菌分子鑒定

1.4.1 16S rRNA的PCR擴(kuò)增和測序 以提取菌株的總DNA為模板，采用細(xì)菌16S rRNA通用引物fD1/rD1[8]進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：其中2x EsMasterMix（Dye）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司） 12.5 μL，模板DNA 1.0 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)體系配好后放入PCR儀（Thermal Cycler S1000）中進(jìn)行反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，退火溫度60℃，時間為30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸2 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，得到單一目的條帶后將PCR產(chǎn)物送至南京擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.4.2基因的PCR擴(kuò)增和測序 由于基因能夠在芽胞桿菌的近緣種間進(jìn)行有效區(qū)分和鑒定[9]，本研究對分離細(xì)菌的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析。以提取菌株的總DNA為模板，利用引物對UP1/UP2r[10]對基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：其中2x EsMasterMix（Dye）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）12.5 μL，模板DNA 1.0 μL，引物（10 μmol·L-1）各0.5 μL，ddH2O 10.5 μL。將配置好的PCR混合物放入PCR儀（Thermal Cycler S1000）中進(jìn)行反應(yīng)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，退火溫度58 ℃，時間為30 s，72 ℃延伸45 s，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸2 min。經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，得到單一目的條帶后將PCR產(chǎn)物送至南京擎科生物技術(shù)有限公司測序。

1.4.3 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 采用DNAstar V7.10將獲得的序列進(jìn)行檢查和同源性分析，同時在National center for biotechnology information（NCBI）數(shù)據(jù)庫中利用BLAST工具進(jìn)行序列同源性搜索，明確與測試菌株序列同源性高的參考菌株及其物種；同時將供試菌株的基因序列與從GenBank下載的近緣種參考菌株序列，通過MEGA X 10.1.8軟件采用鄰接法（Neighbour-Joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析細(xì)菌分離物與已知參考菌株的親緣關(guān)系，以確定測試菌株的分類地位。

1.5 生理生化性狀測定

測定分離細(xì)菌的生理生化性狀，主要包括：革蘭氏染色、厭氧性測定，氧化酶反應(yīng)，接觸酶反應(yīng)，檸檬酸鹽利用，10 ℃、30 ℃和45 ℃條件生長，pH5、pH6和pH7生長，明膠液化，酪蛋白、淀粉水解，碳源（聚乙二醇、甘油、山梨醇）利用，氨基酸（L-甘氨酸、L-酪氨酸）利用。具體方法參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 酥瓜果實(shí)斑點(diǎn)病癥狀

病害初期，瓜皮表面有水浸狀斑點(diǎn)，圓形或卵圓形，病斑微隆起果實(shí)表面，擴(kuò)展后病斑中心呈褐色或灰白色，后期表皮組織變軟（圖1-A,C）。沿果實(shí)病斑發(fā)病部位縱向切開，表皮下層果肉呈黃褐色并伴有水浸狀腐爛（圖1-B）。健康酥瓜果實(shí)表面和內(nèi)部沒有該癥狀（圖1-D, E）。

A和C：田間發(fā)病酥瓜果實(shí)的表面癥狀；B: 田間發(fā)病果實(shí)的內(nèi)部癥狀；D和E: 健康的酥瓜果實(shí)。

Figure 1 Symptoms of bacterial fruit spot on crisp melon from the fields in Huainan of Anhui Province

圖2 測試菌株接種在煙草葉片上48 h后的過敏性壞死反應(yīng)

Figure 2 Hypersensitive reaction on tobacco leaves induced by tested bacterial isolates 48 h after inoculation

2.2 病原菌分離與煙草過敏性壞死反應(yīng)測定

采用平板劃線法從來源于淮南不同田塊的8個病果中，均分離獲得細(xì)菌菌落形態(tài)相似的單菌落，隨機(jī)選取36株保存?zhèn)溆谩Ｔ摷?xì)菌在NA培養(yǎng)基上菌落為乳白色、光滑、邊緣整齊，直徑約2 mm。將細(xì)菌分離物接種煙草葉片，觀察測試菌株的過敏壞死性反應(yīng)。結(jié)果表明，測試的菌株接種煙草葉片24～48 h后，均能引起煙草過敏性壞死（圖2）。

2.3 致病性測定結(jié)果

將獲得的細(xì)菌菌株制成細(xì)菌懸浮液，采用無菌牙簽蘸取菌液、刺傷接種酥瓜健康果實(shí)。測試菌株接種酥瓜果實(shí)6 d后，果實(shí)接種點(diǎn)部位變軟，周圍出現(xiàn)水浸狀病班（圖3-A）；沿發(fā)病部位將果實(shí)切開，可觀察到果實(shí)表皮下層組織變?yōu)辄S褐色，伴有不同程度的組織腐爛（圖3-B, C），與田間發(fā)病的果實(shí)內(nèi)部組織癥狀相似；而用滅菌牙簽蘸無菌水刺傷接種的酥瓜果實(shí)，則在果實(shí)接種點(diǎn)表面和內(nèi)部均未觀察到發(fā)病癥狀（圖3-D, E）。采用平板劃線法從人工接種發(fā)病的酥瓜上重新分離病原，得到與測試細(xì)菌的菌落形態(tài)一致的細(xì)菌分離物，經(jīng)生理生化試驗(yàn)和基因序列分析證實(shí)是，符合和完成柯赫氏法則。

A: 酥瓜接種6 d后的表面癥狀；B和C：Y1菌株接種酥瓜6 d后的內(nèi)部癥狀；D和E：無菌水接種6 d后的內(nèi)部癥狀。

Figure 3 Artificially inoculated fruit of crisp melon by toothpick inoculation method within 6 d

圖4 基于gyrB基因序列構(gòu)建的2株細(xì)菌及相關(guān)近緣種菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

Figure 4 Phylogenetic tree constructed based on thegene sequences from the two representative strains and closely related species in

2.4 病原菌分子鑒定

通過對2株代表性菌株（Y1和Y2）擴(kuò)增16S rRNA片段和測序，分別獲得長度為1437 bp和 1436 bp的核苷酸序列（MF967216和MF967217）。利用DNAstar V7.10軟件分析2條序列，結(jié)果顯示2株細(xì)菌的16S rRNA序列相似度為99.7%。BLAST分析結(jié)果表明，2株細(xì)菌的16S rRNA序列與已報道的GR-8（CP009108）[12]，ATCC 7061（ABRX01000003）[13]和 C4（CP011109）的同源性為99.93%、99.58%和99.86%。采用基因的專化引物從這2株細(xì)菌的基因組DNA中擴(kuò)增得到長度約1.2 kb的目的片段，經(jīng)測序分別得到1142 bp和1132 bp的核苷酸序列（MF968898和MF968899），2株細(xì)菌的基因序列相似性為100%。BLAST分析結(jié)果顯示，2株菌株的基因序列與C4（CP011109）、GR-8（CP009108）的同源性分別為99.39%和98.77%?；谝褕蟮赖难堪麠U菌不同模式種菌株[14]及相關(guān)參考菌株，通過對本研究測序菌株和芽胞桿菌屬內(nèi)21株近緣種的序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明，選取的2株細(xì)菌與C4（CP011109）和GR-8（CP009108）緊密的聚在一起，親緣關(guān)系最近（圖4）。

2.5 生理生化性狀測定結(jié)果

對選取的2株細(xì)菌分離物進(jìn)行了生理生化試驗(yàn)（表1）。結(jié)果表明，測試菌株表現(xiàn)出一致的生理生化特征。該細(xì)菌為革蘭氏陽性、氧化酶反應(yīng)陽性、厭氧生長陰性、接觸酶反應(yīng)陽性；在10℃、30℃條件下可以生長，45℃條件下不能生長；pH5條件下不能生長，pH6、pH7條件下可以生長；可水解酪蛋白和利用檸檬酸鹽；不能使明膠液化、不能水解淀粉、不能利用甘油、山梨醇、聚乙二醇、酪氨酸和甘氨酸。本研究測試菌株的生理生化特征與已報道的ATCC 7061T [13,15]的相似。

表1 測試細(xì)菌菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果

注：‘+’代表陽性，‘-’代表陰性，‘nd’代表沒有數(shù)據(jù)。a數(shù)據(jù)來源于參考文獻(xiàn)[15]。

3 討論與結(jié)論

本研究對引起淮南地區(qū)酥瓜果實(shí)斑點(diǎn)病的病原進(jìn)行了分離，將獲得的細(xì)菌培養(yǎng)物接種煙草，其均能使煙草產(chǎn)生過敏性壞死反應(yīng)；接種健康酥瓜果實(shí)均能導(dǎo)致果實(shí)產(chǎn)生水浸狀壞死斑，并伴有表皮下層組織黃褐色腐爛，與田間發(fā)病果實(shí)的癥狀相似。采用平板劃線法從果實(shí)發(fā)病組織重新分離，獲得與先前接種的菌落形態(tài)一致的細(xì)菌菌落。通過對選取菌株的生理生化試驗(yàn)、16S rRNA和基因序列分析，確定短小芽胞桿菌是引起酥瓜果實(shí)斑點(diǎn)病的病原菌。

由于16S rRNA序列在細(xì)菌屬內(nèi)的高度保守性，對種間相似度很高的近緣種做進(jìn)一步的鑒別較為困難[16]。有研究表明，和的親緣關(guān)系很近，尤其在16S rRNA序列同源性上達(dá)到99%，但兩者在部分生理生化特征方面表現(xiàn)出顯著的差異[15]。例如，能水解酪蛋白、可以利用檸檬酸鹽、不能使明膠液化、不能水解淀粉、不能利用甘油、山梨醇、聚乙二醇、酪氨酸和甘氨酸等，而則在這些生理生化方面表現(xiàn)出不同的特征。本研究測試菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果與已報道的ATCC 7061T的生理生化特征[13, 15]相吻合。近年來研究認(rèn)為，基因在細(xì)菌近緣種，尤其在芽胞桿菌屬內(nèi)種的分類和鑒定中具有較好的區(qū)分能力[10]。本研究中測試的2株細(xì)菌與C4的序列同源性高于99%，與（JOVS02000003）、（CP017786）的序列同源性分別為98%和93%。通過基因序列的聚類分析，結(jié)果顯示這2株細(xì)菌與的親緣關(guān)系最近。

近年來由細(xì)菌引起植物病害的報道呈上升趨勢。2003年該細(xì)菌在西班牙被報道可侵染蕓豆而引起葉片褐斑[17]，2013和2019年在中國相繼發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌可引致生姜根腐病[12]，貯藏期馬鈴薯塊莖軟腐病[18]，同時該細(xì)菌被報道也可侵染無花果而導(dǎo)致果實(shí)腐爛[19]。本研究發(fā)現(xiàn)細(xì)菌可侵染酥瓜而引起果實(shí)斑點(diǎn)病。酥瓜作物在安徽淮南地區(qū)廣泛種植，是地方經(jīng)濟(jì)發(fā)展中的特色產(chǎn)業(yè)，為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的創(chuàng)業(yè)增收發(fā)揮著重要作用。酥瓜果實(shí)斑點(diǎn)病的發(fā)生嚴(yán)重降低了酥瓜果實(shí)品質(zhì)，極大影響了酥瓜的銷售和經(jīng)濟(jì)效益。本研究明確了引起淮南地區(qū)酥瓜果實(shí)斑點(diǎn)病的病原菌為，這為該病害的流行監(jiān)測和進(jìn)一步的有效治理提供了科學(xué)依據(jù)。由于酥瓜在我國黃淮海地區(qū)的種植規(guī)模呈逐年擴(kuò)大趨勢，在接下來的研究中，仍需進(jìn)一步明確植物病原菌的田間侵染和傳播規(guī)律，揭示該病原細(xì)菌的致病機(jī)理，從而為該病害的預(yù)測預(yù)報和抗病品種選育提供科學(xué)理論指導(dǎo)。

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Identification of the pathogen causing bacterial fruit spot of crisp melon

CHENG Xunhui1, ZHANG Lixin2, WANG Jingjing3, SONG Jianghua1

(1. School of Horticulture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;2. School of Plant Protection, Anhui Agricultural University, Hefei 230036;3. Huainan Institute of Agricultural Sciences, Huainan 232008)

To clarify the causal agent of bacterial fruit spot of crisp melon, it was conducted for the bacterial isolation from the symptomatic fruits by plate streaking method in this study. The isolates were tested for pathogenicity assays on the fruit of crisp melon, and the identification by physiological and biochemical tests and molecular methods. A total of 36 bacterial isolates with consistent appearance were recovered from symptomatic tissues. The tested isolates induced hypersensitive reactions on tobacco leaves within 48 h after infiltration and caused water-soaked necrosis in the fruit tissues with the toothpick inoculation method. BLAST results showed that the sequences of 16S rRNA of the two representative strains were 99.93% and 99.58% identity withGR-8 (CP009108) and ATCC 7061(ABRX01000003), respectively. And the sequences ofgene of the two strains were 99.39% identity with that ofC4 (CP011109). Furthermore, a phylogenetic analysis of thesequences showed that the two strains were most closely related toC4 and GR-8 in the phylogenetic tree. The physiological and biochemical tests indicated the characteristics of these bacterial isolates were consistent with those of reference strainsof. Based on the physiological and biochemical characteristics, sequences analysis of 16S rRNA andgene, and verified identified Koch's postulate, the pathogen causing fruit spot of crisp melon was identified as.

crisp melon; fruit spot disease; identification;

S652.908; S436.5

A

1672-352X (2021)01-0052-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210319.019

2021-3-23 11:15:39

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20210319.1548.038.html

2019-12-23

合肥市關(guān)鍵技術(shù)重大研發(fā)項(xiàng)目（ZR201711290010）和安徽省科技重大專項(xiàng)（18030701211）共同資助。

程勛輝，碩士研究生。E-mail：1210385879@qq.com

宋江華，博士，教授。E-mail：jhsong@ahau.edu.cn