番茄WD40家族SlWDR204調(diào)控植株形態(tài)建成的功能分析

張 琳，宗 寧，劉 奎，趙煥蘭，苗 敏

番茄WD40家族204調(diào)控植株形態(tài)建成的功能分析

張 琳，宗 寧，劉 奎，趙煥蘭，苗 敏*

(合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，合肥 230601)

作物的株高是非常重要的農(nóng)藝性狀，影響農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量。植物中WD40蛋白在細(xì)胞周期調(diào)控等方面具有重要作用?？寺×朔?04基因，利用植物基因工程技術(shù)，構(gòu)建植物過表達(dá)載體pBI121-35S::204，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。生物信息學(xué)分析表明該蛋白含有典型的WD40蛋白基序。定量RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)在番茄各器官及果實(shí)發(fā)育不同時期該基因均有表達(dá)。觀察發(fā)現(xiàn)204過表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株相對于野生型植株，表現(xiàn)出較長的莖稈長度，表明該基因是番茄植株高度的正向調(diào)控因子。酵母雙雜交文庫篩選發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子SlSPL3與SlWDR204具有相互作用，SlWDR204與SlSPL3可能共同調(diào)控番茄植株的莖桿發(fā)育。該研究增加了對番茄WD40蛋白參與株高調(diào)控的認(rèn)知。

番茄；204基因；株高；轉(zhuǎn)錄因子；3基因

植株的株高是非常重要的農(nóng)藝性狀，影響農(nóng)作物的品質(zhì)和產(chǎn)量，株高相關(guān)基因功能的研究，對作物的育種和生產(chǎn)提供重要的指導(dǎo)意義。植物莖稈的生長發(fā)育可受多種因素的影響，主要包括植物激素、細(xì)胞周期、轉(zhuǎn)錄因子、蛋白質(zhì)的修飾、細(xì)胞壁的合成、光合產(chǎn)物合成及轉(zhuǎn)運(yùn)等相關(guān)基因的表達(dá)和調(diào)控[1-3]。番茄中1基因通過調(diào)控油菜素內(nèi)酯的信號傳導(dǎo)通路，發(fā)揮其調(diào)控植物生長發(fā)育的功能，1基因沉默可導(dǎo)致植株幼苗下胚軸縮短，營養(yǎng)生長期植株矮化[4]。番茄3-15基因通過調(diào)節(jié)番茄體內(nèi)生長素（IAA）的含量影響植株生長，過表達(dá)3-15基因，可導(dǎo)致植株矮化[5]。水稻10基因通過抑制節(jié)間的細(xì)胞分裂及伸長相關(guān)基因的表達(dá)，降低水稻的株高[6]。擬南芥轉(zhuǎn)錄因子ICE1與赤霉素（GA）合成基因34的啟動子相結(jié)合，抑制該基因的表達(dá)，在1-的突變植株中，該赤霉素合成基因的表達(dá)量上升，GA含量增加導(dǎo)致植株變高[7]。水稻的DDM1參與DNA的甲基化，該蛋白功能的缺失導(dǎo)致許多重復(fù)序列和轉(zhuǎn)座子DNA甲基化的程度下降，使水稻的株高變矮[8]。水稻的纖維素合成酶CSLF6是細(xì)胞壁合成途徑中的重要成員，該蛋白功能缺失導(dǎo)致水稻株高變矮[9]。植株中調(diào)控株高相關(guān)機(jī)制研究大多與激素合成及其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)，而其他調(diào)控機(jī)制的研究較少。

WD40蛋白又被稱作為WD-repeat蛋白，此類蛋白的WD基序約含有40 ~ 60個氨基酸殘基，一般由4 ~ 10個高度保守的串聯(lián)重復(fù)的WD組成。其N 端有一個甘基酸組氨酸二肽（Gly-His，GH），C 端有一個色氨酸天冬氨酸二肽（Trp-Asp，WD）。WD40蛋白廣泛存在真核生物中，在細(xì)菌中也有報(bào)道[10-11]。WD40家族蛋白作為CUL4-DDB1泛素連接酶復(fù)合體的成員，參與底物的識別和結(jié)合，通過對底物的泛素化修飾而調(diào)節(jié)蛋白的穩(wěn)定性或細(xì)胞定位而參與調(diào)控植物的生長發(fā)育以及脅迫響應(yīng)進(jìn)程等生理活動[12]，包括細(xì)胞質(zhì)的移動、細(xì)胞的分裂、細(xì)胞的程序性死亡、花的發(fā)育、結(jié)果、光的信號感受和傳導(dǎo)等[13-14]。在擬南芥和煙草中發(fā)現(xiàn)WD40蛋白參與植物株高的調(diào)節(jié)，擬南芥WD40蛋白Atlg65030通過調(diào)控細(xì)胞的有絲分裂而影響植物生長發(fā)育，該蛋白功能的缺失，導(dǎo)致擬南芥在營養(yǎng)生長期的長勢較弱小[15]；煙草的WD40蛋白NtTTG2可調(diào)控生長素受體因子（ARF）的表達(dá)，2可增加8、17和19的表達(dá)，正調(diào)控植物的株高[16]。而在番茄中，WD40蛋白對株高的調(diào)控尚鮮見報(bào)道，因此，作者對番茄WD40蛋白SlWDR204調(diào)控植株高度的功能進(jìn)行探討。

番茄中含有100個WD40蛋白，調(diào)控多種生理活動機(jī)制[17]。 SlWDR204是WD40家族的成員之一，前期研究表明，SlWDR204通過參與切除修復(fù)受損的DNA而響應(yīng)紫外線脅迫應(yīng)答[18]以及正調(diào)控植物對干旱的耐受性[19]。SlWDR204作為WD40蛋白，在植物生理的研究中主要是集中在植物脅迫響應(yīng)方面。本研究克隆了番茄的204基因，分析該基因在番茄各組織中的表達(dá)譜，以204基因的編碼序列為靶標(biāo)，作者構(gòu)建了204基因的過量表達(dá)載體pBI121-35S::204，并利用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組基因轉(zhuǎn)化到野生型番茄中，分析204過表達(dá)植株中該基因的表達(dá)水平的提高，以增加番茄植株的株高。

1 材料與方法

1.1 材料

番茄（Mill. cv. Ailsa Craig），來自美國康奈爾大學(xué)植物研究所（THOMPSON），由本實(shí)驗(yàn)室繁育保存；pBI121-35S載體，農(nóng)桿菌（）EHA105菌株、酵母菌（）EGY48菌株，均為本實(shí)驗(yàn)保存；酵母雙雜交載體pEG202和pJG4-5來自美國愛達(dá)荷大學(xué)Fangming Xiao教授的實(shí)驗(yàn)室。反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DNA聚合酶、T4連接酶、限制性內(nèi)切酶以及質(zhì)粒提取試劑盒等常用試劑信息見表1。

表1 常用試劑信息

1.2 方法

1.2.1 番茄204基因的表達(dá)譜測定 根據(jù)番茄204（Solyc09g031610. 2. 1）的基因組序列，設(shè)計(jì)該基因的定量引物為204RTF和204RTR，以番茄的3為內(nèi)參基因（引物序列見表2），利用熒光定量PCR（qRT-PCR）技術(shù)檢測204基因在番茄野生型（AC+）植株的根（Root）、莖（Stem）、葉（Leaf）、花（Flower）、成熟綠果（MG，Mature green）、破紅果實(shí)（BR，Break red）和成熟紅果（RR，Ripe red）各器官中的表達(dá)量。

1.2.2204的過表達(dá) 根據(jù)番茄204（Solyc09g031610. 2. 1）基因設(shè)計(jì)特異性引物204FI和204RI（引物序列見表2），擴(kuò)增所得PCR產(chǎn)物，使用限制性內(nèi)切酶I和I酶切PCR產(chǎn)物，并使用T4連接酶連接至載體pBI121，II為篩選標(biāo)記基因，載體的結(jié)構(gòu)圖如圖1所示。

1.2.3 番茄204-OE轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建 將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化入農(nóng)桿菌EHA105中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，構(gòu)建番茄pBI121-35S::204轉(zhuǎn)基因愈傷組織[20]。愈傷組織在不同濃度卡那霉素MS培養(yǎng)基上篩選再分化成苗后，移栽至溫室培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為光照18 h，黑暗6 h，溫度26 ℃。待幼苗恢復(fù)生長狀態(tài)后，取葉片提取植物DNA，采用PCR擴(kuò)增標(biāo)記基因II進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株鑒定。鑒定引物為IIF和IIR，具體引物序列見表2。

表2 本研究使用引物信息

圖1 構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植物過表達(dá)載體原理圖

Figure 1 Schematic diagram of constructing transgenicoverexpression vector

1.2.4 qRT-PCR分析番茄204轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá) Trizol法提取204轉(zhuǎn)基因植株以及野生型植株幼嫩葉片的RNA，提取后的RNA用abm反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行定量PCR的鑒定。定量引物分別為204RTF以及204RTR，番茄3為內(nèi)參基因（引物序列見表2）。選取目的基因204表達(dá)水平顯著性升高的過表達(dá)植株及表達(dá)水平顯著降低的下調(diào)表達(dá)植株進(jìn)行表型分析。

1.2.5 酵母雙雜交篩選及驗(yàn)證 根據(jù)番茄基因204（Solyc09g031610.2. 1）序列設(shè)計(jì)含酶切位點(diǎn)R I和I的特異性引物，通過限制內(nèi)切酶和T4連接酶將目的基因的編碼序列構(gòu)建至載體pEG202。將重組誘餌質(zhì)粒pEG202-204轉(zhuǎn)化至酵母菌株EGY48中，將番茄文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至帶有誘餌質(zhì)粒的酵母克隆中，于營養(yǎng)缺陷型三缺培養(yǎng)基（-Ura，-His，-Trp）進(jìn)行篩選培養(yǎng)。將克隆轉(zhuǎn)至營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基（-Ura，-His，-Trp，-Leu）和顯色培養(yǎng)基（-Ura，-His，-Trp，X-gal）中篩選相互作用的陽性克隆。提取陽性克隆質(zhì)粒并進(jìn)行測序鑒定[21]，所用引物序列見表2。

根據(jù)3（Squamosa promoter binding-like protein）基因（Solyc07g062980.2）設(shè)計(jì)含酶切位R I和I的特異性引物3FR I和3RI（引物序列見表2），將該基因構(gòu)建至載體pJG4-5中，所得質(zhì)粒pJG4-5-3，與原誘餌質(zhì)粒pEG202-204共同轉(zhuǎn)化至酵母菌株EGY48中，驗(yàn)證SlSPL3與SlWDR204之間的相互作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄SlWDR204蛋白結(jié)構(gòu)域以及同源序列分析

番茄204基因的編碼區(qū)為1 764 bp，位于番茄第9號染色體上，所編碼的蛋白質(zhì)長度587aa[17]。通過蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析網(wǎng)站（www.sbg.bio.ic.ac.uk）分析SlWDR204的氨基酸序列的三維結(jié)構(gòu)(圖2A)，DWD-box位于蛋白空間結(jié)構(gòu)偏表層的位置，圖中黑色結(jié)構(gòu)即為DWD-box結(jié)構(gòu)域(圖2B)，預(yù)測該結(jié)構(gòu)域主要與DNA損傷位點(diǎn)的組蛋白結(jié)合的功能有關(guān)，啟動DNA-UV損傷修復(fù)的調(diào)控；SlWDR204蛋白含有1個保守的DWD（DDB1 binding WD40）模塊和2個重復(fù)WD-40 repeat結(jié)構(gòu)域，對番茄SlWDR204的氨基酸序列與其他物種的同源蛋白進(jìn)行同源分析（圖2C），發(fā)現(xiàn)煙草NtDDB2（NW-015866056.1）、擬南芥AtDDB2（ANP-200684.2）及水稻OsDDB2（NC-029256.1）的氨基酸序列與SlWDR204的同源性較高，這些蛋白的氨基酸一致性均達(dá)到50%以上，說明SlWDR204是DDB2同源蛋白且在植物中相對保守。

2.2 番茄SlWDR204基因的表達(dá)模式分析

為進(jìn)一步研究番茄204基因的分子生物學(xué)功能，分析該基因在番茄各組織中的表達(dá)模式，利用qRT-PCR測定番茄的不同器官中，如根、莖、葉、花以及不同時期果實(shí)中204基因的表達(dá)水平。研究發(fā)現(xiàn)，204基因在番茄各組織均有表達(dá)（圖3），說明該基因可在多個器官中行使功能，調(diào)控多種生長發(fā)育機(jī)制。該基因于根、莖、葉、花的表達(dá)水平相近，在成熟綠果、破紅果實(shí)以及成熟紅果中的表達(dá)水平逐漸上升，而在成熟紅果中的表達(dá)水平最高，顯著高于番茄的其他組織。

A. SlWDR204蛋白的三維結(jié)構(gòu)圖；B. DWD-box在SlWDR204蛋白空間結(jié)構(gòu)的位置，圖中黑色箭頭所指虛線框中的黑色結(jié)構(gòu)為DWD-box結(jié)構(gòu)域；C. SlWDR204蛋白與其他物種中同源蛋白的氨基酸序列比對圖（同源序列已用相同背景的顏色標(biāo)出）。

Figure 2 Domain analysis of SlWDR204 protein and sequence alignment with other homologous proteins

圖 3 SlWDR204基因在番茄各組織中的表達(dá)模式

Figure 3 Expression pattern of204 gene in various tissues of

2.3 SlWDR204過表達(dá)和RNAi的轉(zhuǎn)基因植株鑒定

前期的研究已獲得番茄204基因的下調(diào)表達(dá)植株[19]。為進(jìn)一步研究番茄204基因的功能，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)番茄轉(zhuǎn)化獲得204基因過量表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株。qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)基因植株中204基因的表達(dá)量。其中下調(diào)表達(dá)植株（RNAi）中有兩株基因水平顯著下調(diào)，表達(dá)量分別為野生型（AC+）表達(dá)量的0.3和0.4；過表達(dá)植株（OE）中有兩株基因水平顯著上調(diào)，表達(dá)量分別為野生型（AC+）表達(dá)量的6.2和4.3 (圖4)。

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的SlWDR204基因表達(dá)量的qRT-PCR分析

Figure 4 qRT-PCR analysis of204 gene expression in204 transgenic plants

2.4 番茄SlWDR204基因的過表達(dá)影響植株的株高

對6周齡的轉(zhuǎn)基因植株的株高進(jìn)行測量，發(fā)現(xiàn)204過表達(dá)株系的株高顯著高于野生型，204基因的表達(dá)量上調(diào)可增加植株的株高；而RNAi沉默株系的株高與野生型相比，沒有顯著的變化，具體見圖5A和圖5B。說明在番茄204基因正調(diào)控番茄植株的高度，但由于番茄中有100個WD40蛋白，存在功能冗余，導(dǎo)致204下調(diào)表達(dá)并未表現(xiàn)出植株的矮化。

A. 生長6周的番茄植株株高；B. 株高的測量數(shù)據(jù)。

Figure 5 Plant height of transgenic

圖6 SlSPL3和SlWDR204在酵母中具有相互作用

Figure 6 SlSPL3 interacts with SlWDR204 in yeast

2.5 SlWDR204與SlSPL3轉(zhuǎn)錄因子具有相互作用

利用酵母雙雜交系統(tǒng)，篩選番茄cDNA文庫中與SlWDR204具有相互作用的蛋白，得到番茄的SlSPL3轉(zhuǎn)錄因子與SlWDR204具有相互作用，且篩選出3個重復(fù)的克隆均為SlSPL3的部分片段。為驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄因子SlSPL3的全長蛋白與SlWDR204的相互作用，將pEG202-204和pJG4-5-3共轉(zhuǎn)化至酵母菌株EGY48中（圖6A），分別設(shè)置pEG202-204和pJG4-5（圖6B）、pEG202和pJG4-5-3（圖6C）為兩組負(fù)對照。在三缺顯色培養(yǎng)基Gal/Raff（-Ura，-His，-Trp，X-gal）上30 ℃培養(yǎng)24 h后觀察陽性藍(lán)色克隆。含有pEG202-204和pJG4-5-3的酵母克隆顯示藍(lán)色，而兩組負(fù)對照均未顯示藍(lán)色，說明SlSPL3轉(zhuǎn)錄因子全長蛋白與SlWDR204蛋白具有相互作用。

3 討論與結(jié)論

對番茄SlWDR204蛋白的氨基酸和蛋白結(jié)構(gòu)域的分析結(jié)果表明，該蛋白含有2個保守的WD40-repeat基序，與多種植物種中參與紫外修復(fù)的WD40蛋白DDB2的同源性較高，暗示該蛋白參與紫外損傷修復(fù)進(jìn)程，且極有可能是通過作為CUL4-DDB1泛素連接酶復(fù)合物中組分而發(fā)揮作用。204的組織表達(dá)模式顯示該基因在各組織中均有表達(dá)，表明該基因參與番茄多種生長發(fā)育過程；特別是在果實(shí)發(fā)育的破色期與成熟期表達(dá)量較高，暗示204極有可能調(diào)控番茄果實(shí)的成熟及相關(guān)生理特性。

前期研究發(fā)現(xiàn)204基因正調(diào)控植物的干旱脅迫，204基因的下調(diào)表達(dá)導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因番茄植株對干旱的耐受性降低[19]。在番茄中過量表達(dá)204基因時，發(fā)現(xiàn)番茄的株高隨著204基因表達(dá)量的增加而增高，說明該基因正調(diào)控植株的莖桿發(fā)育。而204基因下調(diào)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植株的高度無明顯改變，可能與WD40家族的基因冗余有關(guān)。

WD40蛋白在生物體內(nèi)一般作為底物蛋白識別因子而發(fā)揮作用。為深入探究204基因的功能，我們利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選番茄中與SlWDR204具有相互作用的蛋白，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子SlSPL3與SlWDR204具有相互作用。前期的研究表明SlWDR204定位于細(xì)胞核[19]，表明SlSPL3轉(zhuǎn)錄因子在細(xì)胞核中與SlWDR204蛋白發(fā)生相互作用。SPL轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控植物的生殖生長發(fā)育及響應(yīng)脅迫等生理活動中發(fā)揮重要作用[22]。有研究發(fā)現(xiàn)水稻3調(diào)控植株的高度，水稻株高相關(guān)基因的表達(dá)受轉(zhuǎn)錄因子3的靶向調(diào)節(jié)，過表達(dá)3基因激活株高相關(guān)基因的表達(dá)，從而導(dǎo)致水稻株高增加[23]。在番茄中SlWDR204極有可能通過CUL4-DDB1- SlWDR204復(fù)合體泛素化修飾底物蛋白SlSPL3，影響其活性或穩(wěn)定性從而實(shí)現(xiàn)對株高性狀的調(diào)節(jié)。下一步我們將通過3轉(zhuǎn)基因植株的構(gòu)建、SlSPL3蛋白活性與穩(wěn)定性、SlSPL3靶向調(diào)節(jié)基因等深入研究，進(jìn)一步解析SlWDR204與底物SlSPL3參與調(diào)控植株高度的分子生物學(xué)機(jī)制。

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The functional analysis ofWD40 family204 in regulating plant morphogenesis

ZHANG Lin, ZONG Ning, LIU Kui, ZHAO Huanlan, MIAO Min

(School of Food and Biological Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230601)

The plant height of crop is a very important agronomic trait, which affects the quality and yield of crops. The WD40 protein in plants plays an important role in cell cycle regulation. In this study, we cloned the204 gene, constructed the plant over-expression vector pBI121-35S::204 by plant genetic engineering technology, and obtained over-expressed transgenic plants through the-mediated method. The result showed that the protein contains a typical WD40 protein motif by bioinformatics analysis, and quantitative RT-PCR analysis indicated that the gene was expressed at various stages oforgans and fruit development. It was found that the stalk length of204 overexpressing transgenic plants was longer than wild-type plants, indicating a positive regulator of the plant height of. The transcription factors SlSPL3 interacted with SlWDR204 had been revealed by screening of the yeast two-hybrid library. SlWDR204 and SlSPL3 may jointly regulate the stem development ofplants. The recognition of theWD40 protein on the plant height regulator is enhancing.

;204 gene; plant height; transcription factor;3 gene

S641.2; Q945.78

A

1672-352X (2021)01-0040-06

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210319.011

2021-3-23 10:21:25

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.S.20210319.1543.022.html

2020-04-21

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31701059，31970345）資助。

張 琳，碩士研究生。E-mail：785537147@qq.com

苗 敏，博士，副教授。E-mail：minmiao@hfut.edu.cn