杭白菊成花期內(nèi)源激素及相關(guān)基因的動(dòng)態(tài)變化

鄒禮平，潘 鋮，王夢(mèng)馨，李葉云，周建松，沈?qū)W根，韓寶瑜*

杭白菊成花期內(nèi)源激素及相關(guān)基因的動(dòng)態(tài)變化

鄒禮平1，潘 鋮1，王夢(mèng)馨1，李葉云3，周建松2，沈?qū)W根2，韓寶瑜1*

(1. 中國(guó)計(jì)量大學(xué)浙江省生物計(jì)量及檢驗(yàn)檢疫技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018；2. 桐鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心，桐鄉(xiāng) 314500；3. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，合肥 230036)

以‘早小洋菊’和‘晚小洋菊’為試材，測(cè)定2個(gè)品種的在成花期的5種內(nèi)源激素的含量及其相關(guān)基因的表達(dá)量，對(duì)花芽分化和花器官發(fā)育期間莖尖、莖段和葉片3個(gè)部位中內(nèi)源激素的變化、運(yùn)輸和作用進(jìn)行研究。結(jié)果顯示：在花芽分化期，莖尖GA和ABA含量增加顯著，IAA維持高濃度狀態(tài)；隨著花器官的發(fā)育，IAA含量最早出現(xiàn)下降，ABA和GA則下降較晚。不同器官內(nèi)GA含量的差異性與基因表達(dá)量上調(diào)的一致性的特殊現(xiàn)象，揭示GA部分在葉片中合成后向莖尖富集的運(yùn)輸現(xiàn)象；所有部位IAA含量增加，但后期僅莖尖基因合成上調(diào)，可猜測(cè)IAA表現(xiàn)為莖尖富集一段時(shí)間后向下運(yùn)輸，表達(dá)變化顯示ABA也可能存在莖尖富集的現(xiàn)象，但仍需進(jìn)一步研究?？梢?jiàn)適宜濃度的GA、ABA和IAA有利于菊花的花芽分化和花器官發(fā)育，高濃度ABA可使胞間連絲閉合阻礙IAA的輸出和GA輸入，這可能是延遲‘晚小洋菊’開(kāi)花的最主要因素。

杭白菊；植物激素；花芽分化；運(yùn)輸；基因表達(dá)

杭白菊（Ramat）屬于菊科，為多年生宿根亞灌木植物，是著名的浙江中藥材“浙八味”之一。在醫(yī)藥方面，杭白菊具有鎮(zhèn)靜、解熱、養(yǎng)肝、明目等多種藥用價(jià)值，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)證明，杭白菊同樣具有抗炎、抗病毒、抗心血管疾病等作用。杭白菊一般于4—5月壓枝分栽，在8月20日左右打頂后，隨著氣溫降低和日照漸短，完成由營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)的快速轉(zhuǎn)變。與觀賞菊不同，如使用人工補(bǔ)光和遮光手段調(diào)節(jié)花期，將極大增加生產(chǎn)成本[1]。因此，研究成花期內(nèi)源激素的動(dòng)態(tài)變化，對(duì)杭白菊的推廣應(yīng)用和生產(chǎn)具有重要的意義。植物內(nèi)源激素（Plant endogenous hormones）參與植物整個(gè)生命過(guò)程，對(duì)開(kāi)花的影響非常重要[2-3]。在特定的條件下，激素信號(hào)的調(diào)控往往是將不同激素信號(hào)匯集后通過(guò)改變關(guān)鍵開(kāi)花基因的表達(dá)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)[4]。赤霉素（Gibberllins，GA）途徑不但是最早的4條調(diào)控成花途徑之一，GA信號(hào)還參與光周期、年齡、自主和環(huán)境溫度等途徑的調(diào)控[4-7]。與GA拮抗的激素脫落酸(Abscisis acid, ABA)的具體作用尚存在爭(zhēng)議[4, 8]，雖然林貴玉等[9]發(fā)現(xiàn)菊花在花芽分化期ABA含量呈現(xiàn)逐漸升高的現(xiàn)象，與Okuda等[10]認(rèn)為柑橘中ABA與GA3拮抗有利于花芽孕育觀點(diǎn)一致，但李進(jìn)學(xué)等[11]又發(fā)現(xiàn)柑橘花芽誘導(dǎo)期間ABA在處于較低水平，在花原基形成時(shí)才上升到較高水平。外源施加生長(zhǎng)素(Indole-3-acetic acid, IAA)會(huì)影響花朵的正常發(fā)育[12]，Mai等[13]發(fā)現(xiàn)IAA缺陷型突變體（Auxin resistant 2）內(nèi)源自由IAA水平降低，在短日照下延遲開(kāi)花。外源噴灑水楊酸(Salicylic acid, SA)促進(jìn)檸檬樹(shù)植物開(kāi)花[14]，水楊酸甲酯（Methyl salicylate，MeSA）是花香的重要組成，在植物體內(nèi)可與SA相互轉(zhuǎn)化。成花素FT（Flowering locus T）蛋白的合成部位在葉片，但其被運(yùn)送至莖尖才發(fā)揮作用[15]。目前，對(duì)激素的分子機(jī)制研究也較為深入，GA、ABA和IAA等多種激素不但可調(diào)控葉片中（constans）的轉(zhuǎn)錄水平和CO蛋白的活性，影響FT的形成來(lái)調(diào)控開(kāi)花，還參與莖尖FT下游基因的調(diào)控[16-17]。胞間連絲的開(kāi)閉[18]與激素運(yùn)輸密切相關(guān)，激素間的拮抗/協(xié)同等串聯(lián)互作機(jī)制[15]，共同調(diào)節(jié)植物的成花進(jìn)程[19]。目前，菊花的研究較多集中于觀賞菊的花芽分化，對(duì)于大田種植的杭白菊內(nèi)源激素的研究，尤其是整個(gè)成花期的研究報(bào)道較少。

除了研究激素作用含量外，其合成部位、運(yùn)輸?shù)纫彩茄芯繜狳c(diǎn)。赤霉素氧化酶GA20ox和9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙氧合酶（Nine-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED）分別是調(diào)節(jié)GA和ABA含量的關(guān)鍵限速酶，而生長(zhǎng)素YUC家族蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控是植物調(diào)控局部濃度變化的重要手段[15, 20]。異分支酸合成酶(Isochorismate synthase, ICS)是植物水楊酸合成途徑的重要基因，水楊甲酯合成酶(Salicylic acid carboxyl methyltransferases, SAMT)在水楊酸和水楊酸甲酯的動(dòng)態(tài)平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用[21]。因此，本研究對(duì)比兩個(gè)杭白菊主栽品種的莖尖、莖段和葉片3個(gè)部位在成花期的內(nèi)源激素GA、ABA、IAA、SA和MeSA的動(dòng)態(tài)變化及其相關(guān)基因、、和的表達(dá)量，探討花芽分化和花器官發(fā)育期間內(nèi)源激素變化、運(yùn)輸和作用等，以期為研究開(kāi)發(fā)和應(yīng)用外源激素控制杭白菊成花提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 植物材料的管理及取樣

本試驗(yàn)于2018年2月—12月在桐鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)推廣服務(wù)中心的縣良種場(chǎng)品種基地進(jìn)行。選取優(yōu)質(zhì)杭白菊栽培品種‘早小洋菊’（cv. ‘Zaoxiaoyangju’）和‘晚小洋菊’（cv. ‘Wanxiaoyangju’）作為實(shí)驗(yàn)材料，兩個(gè)品種母本來(lái)源一致，經(jīng)人工選育后保留，成花期存在差異。盆栽苗選取長(zhǎng)勢(shì)一致的插穗，扦插生根后移植到塑料大棚內(nèi)，生長(zhǎng)期間進(jìn)行合理的病蟲(chóng)害防治和肥料管理措施[22]。菊花生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程主要可以分為兩大階段，即營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段和生殖生長(zhǎng)階段，其中涉及到營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)化過(guò)程稱之為花芽分化期，參照楊娜[23]、馮楓[24]等對(duì)菊花花芽分化時(shí)間的研究和秋菊‘神馬’的解剖觀察，發(fā)現(xiàn)菊花的花芽分化在短日照條件下被誘導(dǎo)起始，全過(guò)程約歷時(shí)30 d。本研究取樣時(shí)間為2018年8月4日至2018年11月17日，主要分為2個(gè)階段，其中8月4日至10月18日為每間隔15 d取樣1次，共90 d（6個(gè)取樣點(diǎn)），10月18日至11月17日為每間隔10 d取樣1次，共30 d（3個(gè)取樣點(diǎn)）。取樣部位包括莖尖（shoot apexes，花芽分化后期為帶花幼苗）、莖段（stems）和葉片（leaves）3個(gè)組織。上述所有的取樣中，選取長(zhǎng)勢(shì)一致、大小接近的植株，所有樣品均設(shè)置3個(gè)獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)。樣品被獲取后快速投入液氮中冷凍處理，然后保存于–80℃冰箱待測(cè)。

1.2 內(nèi)源激素的測(cè)定

內(nèi)源激素的測(cè)定方法參照前人略有改變[25-27]。液氮研磨樣品后，準(zhǔn)確稱取0.5 g樣品轉(zhuǎn)入離心管中，加入8 mL 預(yù)冷的80%色譜甲醇（）置于4 °C浸提12～16 h，離心20 min（轉(zhuǎn)速7 000 r·min-1），取上清液；殘?jiān)? mL預(yù)冷的80%甲醇分2次沖洗，離心20 min取上清液，合并上清液加入0.2 g PVPP，4 °C震蕩20 min，加入適量無(wú)水硫酸鈉去除水分，離心20 min取上清；上清液過(guò)C18 SPE固相萃取小柱，流出液收集后用高純氮?dú)鉂饪s干燥，用0.5 mL色譜甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm有機(jī)微孔濾膜過(guò)濾至樣品瓶中，用于HPLC檢測(cè)。

測(cè)定儀器采用高效液相色譜（HPLC）儀，型號(hào)：Agilent1260LC；色譜柱：Waters XBridge C18（250 mm×4.6 mm, 5 μm）；檢測(cè)器類型：G1314F紫外檢測(cè)器，柱箱溫度35 °C，不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣體積20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm，流動(dòng)相為（A）色譜甲醇和（B）0.6%乙酸水溶液，梯度洗脫，流速為1 mL·min-1。洗脫程序：0 ~10 min，0 ~ 50% A；10 ~ 30 min，50% ~ 50% A。IAA、GA、ABA、SA和MeSA標(biāo)準(zhǔn)品均購(gòu)自Sigma公司。使用色譜甲醇配置各自溶液，在查看保留時(shí)間和響應(yīng)值的基礎(chǔ)上，配置梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于外標(biāo)法定量。

1.3 基因表達(dá)量的測(cè)定

根據(jù)菊花EST文庫(kù)序列信息，獲得、、、和的基因序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物，合成及后續(xù)測(cè)序由上海生工生物有限公司完成。實(shí)驗(yàn)所用的引物見(jiàn)表1。熒光定量反應(yīng)體系為：TB Green?Premix?II (Tli RNaseH Plus) 12.5 μL，引物F、R各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)充至25 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5 °C熱啟動(dòng)30 s；94 °C 5 s，60 °C 30 s，循環(huán)數(shù)40個(gè)。所有結(jié)果的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差均由3次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)通過(guò)計(jì)算所得。作為內(nèi)參基因被用于計(jì)算表達(dá)量[28-29]，相對(duì)表達(dá)量計(jì)算方法參照2-△△CT（Livak）法[30]。

表1 激素相關(guān)基因的qRT-PCR引物

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有指標(biāo)均重復(fù)測(cè)定3次，結(jié)果均為平均值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用EXCEL 2010或Adobe Illustrator CS6繪制圖譜，數(shù)據(jù)分析使用DPS 9.0軟件的Duncan 多重比較分析顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 杭白菊成花進(jìn)程

本研究共9個(gè)取樣點(diǎn)，根據(jù)前人研究結(jié)合田間觀測(cè)，選取‘晚小洋菊’代表性生長(zhǎng)狀態(tài)拍攝照片，結(jié)果見(jiàn)圖1。根據(jù)楊娜等[23]的分類方法，觀測(cè)發(fā)現(xiàn)‘早小洋菊’與‘早小洋菊’的生長(zhǎng)階段差2～6 d，各采樣點(diǎn)分類在兩個(gè)品種間一致，9個(gè)取樣點(diǎn)分別處于3個(gè)階段，未分化期（8月4日和8月19日）、花芽分化期（9月3日和9月18日）和5個(gè)點(diǎn)的花器官發(fā)育期，又可分為現(xiàn)蕾期（10月3日）、露白期（10月18日）、初綻期（10月28日和11月7日）和盛花期（11月17日）。

Figure 1 Growth periods ofcv. ‘Wanxiaoyangju’

圖 2 GA含量及CmGA20ox基因表達(dá)

Figure 2 Gibberellin content and gene expression of

圖 3 ABA含量及CmNCED基因表達(dá)

Figure 3 Abscisic acid content and gene expression of

2.2 GA含量變化及基因表達(dá)

GA含量在兩個(gè)品種和不同部位間均存在較大差異，在未分化期‘晚小洋菊’莖尖（圖2A）的GA含量是‘早小洋菊’的2倍以上，在莖段（圖2B）和葉片（圖2C）部位未發(fā)現(xiàn)顯著差異；‘晚小洋菊’莖尖GA含量遠(yuǎn)高于是莖段和葉片，花芽分化開(kāi)始后莖尖GA含量是莖段和葉片的2倍以上；但除極個(gè)別外，‘晚小洋菊’在同一時(shí)間點(diǎn)和同一部位的GA含量高于‘早小洋菊’。隨著花芽分化的進(jìn)程、花器官的發(fā)育，GA含量在兩個(gè)品種間呈現(xiàn)較為一致的變化趨勢(shì)，但在花芽分化期至初綻期的不同部位間存在較大差異；在莖尖（圖2A）的GA含量水平呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)，尤其是‘晚小洋菊’的GA含量急速增加至未分化期的3倍以上；而在葉片（圖2C）中則呈現(xiàn)為下降。在莖段（圖2B）中，GA含量不論是在兩個(gè)品種間還是隨著成花進(jìn)程的推移均表現(xiàn)不顯著的波動(dòng)變化。GA合成關(guān)鍵酶基因的相對(duì)表達(dá)量在兩個(gè)品種間也呈現(xiàn)一致的變化趨勢(shì)。在花芽分化期至初綻期，同一部位的基因表達(dá)量與GA含量變化存在一定的關(guān)聯(lián)性。莖尖（圖2D）的表達(dá)量在花芽分化期上調(diào)，尤其是‘晚小洋菊’的花芽分化期表達(dá)量是未分化期2倍以上，此現(xiàn)象與莖尖中GA含量（圖2A）呈正相關(guān)。與之相反的，的表達(dá)量與GA含量在莖段和葉片未呈現(xiàn)正相關(guān)的現(xiàn)象。基因表達(dá)水平在莖段（圖2E）和葉片（圖2F）表現(xiàn)為上調(diào)的趨勢(shì)，部分時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量上調(diào)達(dá)到顯著水平。綜上所述，GA含量在莖尖、莖段和葉片分別呈現(xiàn)上升、不變和下降的趨勢(shì)，而的表達(dá)量在此期間均呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)。因此我們猜測(cè)，在此期間的GA存在GA內(nèi)部運(yùn)輸現(xiàn)象，由葉片經(jīng)莖段向莖尖富集。

圖4 IAA含量及CmYUC基因表達(dá)

Figure 4 Auxin content and gene expression of

圖5 SA含量及CmICS基因表達(dá)

Figure 5 Salicylic acid content and gene expression of

2.3 ABA含量變化及基因表達(dá)

ABA密切參與植物非生物脅迫中的應(yīng)答[31-32]，同時(shí)也參與蛋白質(zhì)和脂質(zhì)合成、種子脫水耐受、種子休眠和開(kāi)花等生長(zhǎng)發(fā)育的過(guò)程[33]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中可見(jiàn)，除‘晚小洋菊’莖尖的ABA含量在花芽分化期至露白期急劇升高外（圖3A），與GA含量在2個(gè)品種間和不同部位間存在較大差異不同，ABA含量在品種間和部位間差異不顯著。隨著花芽分化的進(jìn)程、花器官的發(fā)育，‘早小洋菊’ 3個(gè)部位中的ABA含量呈現(xiàn)增加或波動(dòng)的趨勢(shì)，而‘晚小洋菊’在莖尖（圖3A）和莖段（圖3B）中的ABA含量呈現(xiàn)為先上升后回落的趨勢(shì)，葉片（圖3C）中ABA含量相對(duì)于未分化期大部分樣品表現(xiàn)為下降的趨勢(shì)。ABA關(guān)鍵限速酶基因的相對(duì)表達(dá)量在不同部位間呈現(xiàn)顯著差異的變化趨勢(shì)。在莖尖（圖3D）的表達(dá)量的整體表現(xiàn)為上調(diào)的趨勢(shì)，尤其是‘晚小洋菊’在花芽分化期表達(dá)量上調(diào)倍數(shù)大于2倍以上，大致與ABA含量變化呈正相關(guān)；在葉片（圖3F）中的表達(dá)量與ABA含量也呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)的現(xiàn)象，在莖段（圖3E）部位未發(fā)現(xiàn)顯著的上調(diào)或下調(diào)。

2.4 IAA含量變化及基因表達(dá)

IAA是最早被鑒定的植物激素，影響植物細(xì)胞的伸長(zhǎng)、分化，參與種子發(fā)育、側(cè)根形成、根和葉片的生長(zhǎng)發(fā)育等多種生理過(guò)程[34]，同時(shí)缺乏IAA會(huì)延遲開(kāi)花[13]，外源施加不同濃度IAA會(huì)影響花朵的正常發(fā)育[12]。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，與GA和ABA相比，IAA含量在3個(gè)激素中處于較高水平，同時(shí)在花芽分化期至露白期處于高含量的波動(dòng)狀態(tài)。在未分化期‘早小洋菊’的IAA含量有急劇增加現(xiàn)象（3.5倍以上），但在‘晚小洋菊’中僅有輕微的增加（圖4A）；但I(xiàn)AA合成相關(guān)基因的表達(dá)量在此期間均顯著上調(diào)（圖4D）。隨著花器官的發(fā)育，在初綻期莖尖中IAA含量快速降低，與表達(dá)量變化呈正相關(guān)（圖4A和D）；在莖段中表達(dá)量未呈現(xiàn)顯著上調(diào)或下調(diào)現(xiàn)象，但莖段中IAA含量均增加顯著（圖4B），尤其是‘晚小洋菊’其盛花期IAA含量是露白期的3倍以上，猜測(cè)可能是莖尖IAA向下運(yùn)輸造成。在莖段部位的IAA含量（圖4C）和相關(guān)基因表達(dá)量（圖4F）大部分均處于不顯著的上升或下降的動(dòng)態(tài)平衡中。

圖6 MeSA含量及CmSAMT基因表達(dá)

Figure 6 Methyl salicylate content and gene expression of

2.5 SA含量變化及基因表達(dá)

SA被認(rèn)為在特定的脅迫或其他激素聯(lián)合調(diào)控下可誘導(dǎo)某些植物開(kāi)花[35-36]。本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)莖尖SA的含量與ABA變化趨勢(shì)相類似，在花芽分化期至露白期急劇增加，‘早小洋菊’在10月3日達(dá)到峰值，是9月3日的2倍以上，而‘晚小洋菊’在10月18日達(dá)到峰值，是9月3日的8倍以上（圖5A）；但是SA合成基因的表達(dá)量，僅‘晚小洋菊’在花芽分化期上調(diào)1.5倍，與莖尖SA含量不存在顯著相關(guān)性（圖5D）。在莖段中基因的表達(dá)量相對(duì)未分化期不存在顯著差異（圖5E），但是SA變化趨勢(shì)在兩個(gè)品種間差異較大?！硇⊙缶铡疭A含量呈現(xiàn)顯著上升的趨勢(shì)，尤其是10月28日SA含量達(dá)到未分化期6倍以上；然而SA含量在‘早小洋菊’中表現(xiàn)為波動(dòng)下降的趨勢(shì)，在9月18日其含量低于100 ng·g-1（FW）（圖5B）。與莖尖和莖段不同的是，葉片中兩個(gè)品種的SA含量大部分均表現(xiàn)波動(dòng)上升的趨勢(shì)，‘晚小洋菊’在初綻期后有顯著下降的現(xiàn)象（圖5C）。而隨著花芽分化的進(jìn)程及花器官的發(fā)育，葉片中基因的表達(dá)量表現(xiàn)為上調(diào)趨勢(shì)，尤其是‘晚小洋菊’的在初綻期的表達(dá)量是未分化期的4倍以上（圖5F）。在菊花芽分化的進(jìn)程及花器官的發(fā)育中，SA含量與合成基因不存在顯著聯(lián)系。

2.6 MeSA含量變化及基因表達(dá)

MeSA是SA的衍生物，在植物體內(nèi)很容易轉(zhuǎn)化為SA發(fā)揮作用，同時(shí)MeSA也是重要的花香物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)與GA類似，MeSA的含量在兩個(gè)品種間差異巨大，‘晚小洋菊’的MeSA含量與‘早小洋菊’的差異倍數(shù)最大可以達(dá)到莖尖的8倍、莖段的18倍和葉片的24倍。葉片中MeSA含量與基因表達(dá)量變化一致，‘早小洋菊’中在花芽分化期呈上調(diào)趨勢(shì)，與之一致的是葉片中MeSA含量在花芽分化期也急劇增加，9月18日的MeSA是8月4日的12倍以上；與‘早小洋菊’不同，‘晚小洋菊’MeSA一直維持高水平的波動(dòng)狀態(tài)，相應(yīng)基因也未發(fā)生顯著的上調(diào)或下調(diào)現(xiàn)象（圖6C和F）。莖尖中MeSA表現(xiàn)為顯著增加后急劇下降的趨勢(shì)，兩個(gè)品種的MeSA含量在現(xiàn)蕾期均達(dá)到未分化期的4倍以上（圖6A），基因表達(dá)量在‘晚小洋菊’中呈現(xiàn)為顯著上調(diào)（圖6D）。與莖尖變化趨勢(shì)類似，莖段中MeSA含量在花芽分化期至現(xiàn)蕾期也呈現(xiàn)顯著上調(diào)的現(xiàn)象，在初綻期則降低至較低水平，而此時(shí)莖段中基因的表達(dá)水平未呈現(xiàn)顯著的上調(diào)或下調(diào)現(xiàn)象，可見(jiàn)兩者間不存在顯著相關(guān)性。

3 討論與結(jié)論

植物內(nèi)源激素在植物體內(nèi)構(gòu)建了復(fù)雜完整的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，通過(guò)傳遞外源或內(nèi)源信號(hào)調(diào)控植物的關(guān)鍵開(kāi)花基因的表達(dá)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)開(kāi)花的影響[2-4]。激素在植物體內(nèi)的合成、轉(zhuǎn)移和作用部位等一直是激素研究的熱點(diǎn)。FT蛋白在葉片中合成運(yùn)送至莖尖中調(diào)控成花[15]，因此激素調(diào)控成花的作用部位分為葉片和莖尖，而運(yùn)輸會(huì)涉及到莖段部位。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究檢測(cè)激素含量和相關(guān)基因表達(dá)莖尖、莖段和葉片之間的差異，解析激素在植物體內(nèi)的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)現(xiàn)象。GA含量在莖尖、莖段和葉片分別呈現(xiàn)上升、不變和下降的趨勢(shì)，而的表達(dá)量在此期間均呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)。揭示了成花進(jìn)程中GA存在由葉片經(jīng)莖段向莖尖富集的體內(nèi)運(yùn)輸現(xiàn)象，結(jié)果與前人結(jié)果一致，證實(shí)GA可通過(guò)細(xì)胞膜在細(xì)胞間進(jìn)行運(yùn)輸[37]。但與馮楓等[24]認(rèn)為菊花花芽的生理分化階段GA3從頂芽向葉片運(yùn)輸結(jié)果相反。同時(shí)，馮楓等[24]認(rèn)為低濃度GA有利于頂芽的花芽分化，而本研究通過(guò)對(duì)比‘早小洋菊’和‘晚小洋菊’的GA含量，發(fā)現(xiàn)低濃度GA可能有利于成花進(jìn)程，但結(jié)果仍需深入研究。同樣莖尖IAA含量變化與基因上調(diào)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，在莖段中IAA含量的顯著增加與基因的不顯著變化也存在差異，可發(fā)現(xiàn)在成花后期IAA存在極性向下運(yùn)輸?shù)默F(xiàn)象，這與前人結(jié)果一致[24, 38]。IAA可在植物體內(nèi)存在極性運(yùn)輸并呈現(xiàn)梯度分布，這種動(dòng)態(tài)分布與成花進(jìn)程密切相關(guān)。雖然葉片（圖3F）中ABA含量與的表達(dá)量呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，但在莖尖卻呈現(xiàn)正相關(guān)。前人研究指出ABA形式在植物細(xì)胞間運(yùn)輸較為困難[18]，所以直接ABA的體內(nèi)運(yùn)輸可能不存在，猜測(cè)可能是屬于小家族基因[33]，其成員在不同組織表達(dá)差異較大，這也可能是本次葉片中出現(xiàn)負(fù)相關(guān)的成因。激素調(diào)控成花進(jìn)程的研究報(bào)道越來(lái)越多：GA及GA信號(hào)途徑調(diào)控有利于成花[39-41]；IAA和ABA含量增多也有利于成花轉(zhuǎn)變或花器官發(fā)育，當(dāng)然ABA在不同植物和不同生長(zhǎng)階段具有差異性[10-11, 38, 42]。從本研究中可以發(fā)現(xiàn)，隨著花芽分化的進(jìn)程、花器官的發(fā)育，GA含量在莖尖表現(xiàn)為升高，在葉片表現(xiàn)為下降（圖2）。ABA含量雖然在兩個(gè)品種間有區(qū)別，但花芽分化期間與GA呈現(xiàn)類似規(guī)律，也呈現(xiàn)為在莖尖含量上升（圖3）。林貴玉等[9]也發(fā)現(xiàn)ABA在菊花花芽分化期呈現(xiàn)逐漸升高的現(xiàn)象。而與GA和ABA相比，莖尖IAA含量在3個(gè)激素中處于較高水平，同時(shí)在花芽分化期至露白期處于高含量的波動(dòng)狀態(tài)，在初綻期才急劇下降（圖4）。Jaligot等[12]也發(fā)現(xiàn)外源施加不同濃度IAA溶液會(huì)對(duì)花朵的正常發(fā)育產(chǎn)生不同影響，花孕育需要一定濃度的IAA，但高濃度的外源IAA 抑制成花?？梢?jiàn)一定濃度范圍內(nèi)的GA、ABA和IAA在菊花花芽分化或花器官發(fā)育中均存在促進(jìn)成花的作用。外源施加SA溶液或紫外照射可誘導(dǎo)SA的積累來(lái)抑制野生型擬南芥轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而促進(jìn)開(kāi)花[14]。外源施加SA可逆轉(zhuǎn)突變株的晚花表型，但在長(zhǎng)日照下對(duì)突變株無(wú)顯著改善[43]。本研究也發(fā)現(xiàn)莖尖SA在花芽分化期至露白期急劇增加，莖尖MeSA表現(xiàn)為顯著增加后急劇下降的趨勢(shì)；‘早小洋菊’葉片中MeSA含量在花芽分化期也急劇增加，而‘晚小洋菊’MeSA一直維持高水平的波動(dòng)狀態(tài)。雖然SA和MeSA含量變化與花芽分化或花器官發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)一定的正相關(guān)，但SA和MeSA無(wú)論是含量還是基因變化均呈現(xiàn)一定滯后的現(xiàn)象。同時(shí)MeSA也是重要的花香物質(zhì)，MeSA極易轉(zhuǎn)化為SA發(fā)揮作用，故SA或MeSA等物質(zhì)可能是花芽分化期間誘導(dǎo)產(chǎn)生的，而非誘導(dǎo)成花的關(guān)鍵激素。綜上所述，隨著花芽分化和花器官發(fā)育，GA和IAA 在不同器官內(nèi)呈現(xiàn)運(yùn)輸現(xiàn)象，GA在促進(jìn)成花過(guò)程中為葉片合成向莖尖富集，IAA則在此期間表現(xiàn)為莖尖富集一段時(shí)間后向下運(yùn)輸現(xiàn)象，ABA也有類似現(xiàn)象，但其運(yùn)輸方式仍需進(jìn)一步研究。一定濃度范圍內(nèi)的GA、ABA和IAA在菊花花芽分化或花器官發(fā)育中均存在促進(jìn)成花的作用[44]，同時(shí)高濃度ABA可能促進(jìn)胞間連絲的閉合[18]，阻礙IAA的輸出和GA的輸入，這可能是‘晚小洋菊’開(kāi)花較晚的最主要因素。SA或MeSA等物質(zhì)可能積極參與花芽分化期間花器官發(fā)育，但是否促進(jìn)成花仍需進(jìn)一步研究。

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Dynamic changes of endogenous hormones and related genes ofin flower formation

ZOU Liping1, PAN Cheng1, WANG Mengxin1, LI Yeyun3, ZHOU Jiansong2, SHEN Xuegen2, HAN Baoyu1

3(1. Zhejiang Provincial Key Laboratory of Biometrology and Inspection & Quarantine, China Jiliang University, Hangzhou 310018; 2. Extention Center for Agricultural Techniques of Tongxiang City, Tongxiang 314500;. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036)

The contents of five endogenous hormones and the expression of related genes at flowering stage were measured in two cultivars (cv. ‘Zaoxiaoyangju’ and ‘Wanxiaoyangju’). The changes, transportation and function of endogenous hormones in three parts of shoot apexes, stem and leaf during flower bud differentiation and flower organ development were studied. In the flower bud differentiation stage, the contents of GA and ABA in shoot apexes increased significantly, and the content of IAA maintained a high concentration state; with the development of flower organs, the content of IAA decreased at first, and the contents of ABA and GA decreased later. The differences in GA contents were consistent with the upregulation ofin different organs, which revealed that GA may be synthesized in leaves and enriched to shoot apexes. IAA contents in all parts increased, and the upregulation ofoccurred only in shoot tips, which may be due to the downward transport of IAA after a period of accumulation in shoot apexes. The expression change ofshowed that ABA might also be enriched in shoot apexes, but further study would be needed. ABA also had the phenomenon of top enrichment, but further research would be needed. Appropriate concentrations of GA, ABA and IAA could promote flower bud differentiation and flower organ development of chrysanthemum. High concentration of ABA could promote the closure of plasmodesmata and hinder the output of IAA and the input of GA, which might be the most important factor to delay the flowering of ‘Wanxiaoyangju’.

; plant hormone; flower bud differentiation; transportion; gene expression

S682.11

A

1672-352X (2021)01-0031-09

10.13610/j.cnki.1672-352x.20210319.022

2021-3-23 11:16:10

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20210319.1548.044.html

2020-05-15

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2018YFC1604402)，浙江省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2020C02026)和浙江省基礎(chǔ)公益研究計(jì)劃項(xiàng)目(LGN18C160006, LGN20C140005)共同資助。

鄒禮平，碩士研究生。E-mail：1223760931@qq.com

韓寶瑜，教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：han-insect@263.net