丙泊酚對糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷影響及其機(jī)制

[摘要] 目的 探討丙泊酚對糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的影響及其機(jī)制。

方法 將體外培養(yǎng)的大鼠腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分為對照組、模型組、模型+丙泊酚組、模型+丙泊酚+空載體組和模型+丙泊酚+高遷移率族蛋白1（HMGB1）組，后4組構(gòu)建糖氧剝奪再灌注細(xì)胞損傷模型，后3組給予濃度為10 μmol/L的丙泊酚處理，后兩組分別在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體質(zhì)粒和pcDNA3.1-HMGB1過表達(dá)載體質(zhì)粒后建模。采用噻唑藍(lán)（MTT）法檢測細(xì)胞存活率，比色法檢測乳酸脫氫酶（LDH）漏出率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率，ELISA法檢測細(xì)胞上清液中HMGB1、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，Western blot檢測HMGB1、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）和活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved caspase-3）等蛋白表達(dá)。

結(jié)果 與對照組相比，模型組細(xì)胞存活率和Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，而LDH漏出率、凋亡率和HMGB1、Bax、Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平以及細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α含量均顯著升高（F=171.199～391.008，q=24.398～49.269，Plt;0.05）。給予丙泊酚處理后糖氧剝奪再灌注引起的上述變化均顯著減弱（q=11.711～35.032，Plt;0.05）。成功上調(diào)HMGB1表達(dá)后，丙泊酚對糖氧剝奪再灌注損傷的保護(hù)作用得以逆轉(zhuǎn)。

結(jié)論 丙泊酚可能通過下調(diào)HMGB1表達(dá)抑制細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)對糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 再灌注損傷;星形細(xì)胞;二異丙酚;細(xì)胞凋亡;炎癥;HMGB1蛋白質(zhì)

[中圖分類號] R619.9;R971.2

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2021）06-0903-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2021.57.197

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20211230.1016.002.html;2021-12-30 14：30：46

EFFECT OF PROPOFOL ON ASTROCYTE INJURY INDUCED BY GLUCOSE-OXYGEN DEPRIVATION AND REPERFUSION AND ITS MECHANISM

SONG Haijun， YANG Zuti， LIU Jun， LIU Guolei

（Department of Anesthesiology， Nanyang Nanshi Hospital， Nanyang473000， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the effect of propofol on astrocyte injury induced by glucose-oxygen deprivation and reperfusion and its mechanism.

Methods Rat cerebral cortical astrocytes cultured in vitro were divided into control group， model group， model+propofol group， model+propofol+empty vector group， and model+propofol+high-mobility group box 1 （HMGB1） group. The latter four groups were used to establish a model of cell injury caused by glucose-oxygen deprivation and reperfusion; the latter three groups were treated with propofol at a concentration of 10 μmol/L; the latter two groups were used for modeling after being transfected with pcDNA3.1 empty vector plasmid and pcDNA3.1-HMGB1 overexpression vector plasmid， respectively. MTT assay was used to measure cell viability; colorimetry was used to measure lactate dehydrogenase （LDH） leakage rate; flow cytometry was used to measure cell apoptosis rate; ELISA was used to measure the content of HMGB1， interleukin-1β （IL-1β）， and tumor necrosis factor-α （TNF-α） in cell supernatant， and Western blot was used to measure the protein expression of HMGB1， B-cell lymphoma/leukemia-2 （Bcl-2）， Bcl-2-associated X protein （Bax）， and activated Cleaved caspase-3.

Results Compared with the control group， the model group had significant reductions in cell viability and the protein expression level of Bcl-2 and significant increases in LDH leakage rate， cell apoptosis rate， the protein expression levels of HMGB1， Bax， and Cleaved caspase-3， and the content of HMGB1， IL-1β， and TNF-α in supernatant （F=171.199-391.008，q=24.398-49.269， all Plt;0.05）. The above changes induced by glucose-oxygen deprivation and reperfusion were significantly alleviated after propofol treatment （q=11.711-35.032， all Plt;0.05）. After the expression of HMGB1 was upregulated successfully， the protective effect of propofol against the injury induced by glucose-oxygen deprivation and reperfusion was reversed.

Conclusion Propofol can protect astrocytes against the injury induced by glucose-oxygen deprivation and reperfusion by downregulating the expression of HMGB1 to inhibit cell apoptosis and inflammatory response.

[KEY WORDS]reperfusion injury; astrocytes; Propofol; apoptosis; inflammation; HMGB1 protein

星形膠質(zhì)細(xì)胞是廣泛分布于哺乳動(dòng)物腦內(nèi)的一類非神經(jīng)元細(xì)胞，在腦缺血病理過程中發(fā)揮著保護(hù)和損傷神經(jīng)元的雙重作用[1-3]。高遷移率族蛋白1（HMGB1）是細(xì)胞核內(nèi)一種高度保守的非組蛋白，可作為促炎因子和預(yù)警蛋白在先天性免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用[4-6]。研究證實(shí)，HMGB1在腦缺血后大量升高，且可通過促進(jìn)炎癥遞質(zhì)的釋放和調(diào)控星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡在腦缺血病理過程中發(fā)揮著重要作用[7]。丙泊酚是一種臨床手術(shù)過程中常見的靜脈麻醉藥，被證實(shí)可通過抑制細(xì)胞凋亡和炎癥遞質(zhì)的釋放在腦損傷過程中發(fā)揮保護(hù)作用[8-9]。近年研究顯示，丙泊酚可通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1的表達(dá)調(diào)控腦損傷免疫炎癥系統(tǒng)[10]，但HMGB1在丙泊酚保護(hù)腦缺血誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用并不清楚。腦皮質(zhì)星形膠質(zhì)細(xì)胞糖氧剝奪再灌注模型是研究體內(nèi)腦缺血常用的細(xì)胞模型[11]，本研究從細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)角度出發(fā)，首次探討HMGB1在丙泊酚保護(hù)糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷中的作用，以期為闡明丙泊酚保護(hù)腦損傷的分子機(jī)制提供新依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

SPF級新生Wistar大鼠（體質(zhì)量12～15 g）購于山東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)液和DMEM無糖培養(yǎng)液購于美國Gibco公司。丙泊酚購于美國Sigma公司。兔抗B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）抗體和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體均購于美國CST公司，兔抗活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3（Cleaved caspase-3）抗體和HMGB1抗體購于美國Abcam公司。噻唑藍(lán)（MTT）試劑和乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒購于南京建成生物工程研究所，BCA蛋白檢測試劑盒購于美國Pierce公司。細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、ECL試劑盒及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和HMGB1的ELISA試劑盒購于上海碧云天公司。pcDNA3.1-HMGB1過表達(dá)載體質(zhì)粒購于BioVector質(zhì)粒載體菌種細(xì)胞基因保藏中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組與處理 將新生大鼠處死分離出大腦皮質(zhì)后，剝離腦膜和血管等結(jié)構(gòu)，將獲得的星形膠質(zhì)細(xì)胞參照文獻(xiàn)方法[12]檢測純化培養(yǎng)后以每孔3×105個(gè)細(xì)胞種植于96孔細(xì)胞板上。實(shí)驗(yàn)分為5組，分別為對照組（A組）、模型組（B組）、模型+丙泊酚組（C組）、模型+丙泊酚+空載體組（D組）和模型+丙泊酚+HMGB1組（E組）。其中后4組行糖氧剝奪再灌注處理：棄原培養(yǎng)液后，加入無糖DMEM培養(yǎng)液，放入低氧（含體積分?jǐn)?shù)0.02的O 2）培養(yǎng)箱中于37 ℃下培養(yǎng)6 h（即糖氧剝奪處理）;后3組給藥處理：加入含10 μmol/L丙泊酚的無糖DMEM培養(yǎng)液。糖氧剝奪處理6 h后，從低氧培養(yǎng)箱中取出并棄無糖培養(yǎng)液，加入含10 μmol/L丙泊酚的含糖培養(yǎng)液并培養(yǎng)24 h，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO 2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h（即再灌注處理）。模型+丙泊酚+空載體組：在糖氧剝奪處理前，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟加入pcDNA3.1空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h。模型+丙泊酚+HMGB1組：在糖氧剝奪處理前，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟加入pcDNA3.1-HMGB1過表達(dá)載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HMGB1過表達(dá)載體質(zhì)粒的陰性對照，以排除轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活率 收集處理結(jié)束后的各組細(xì)胞，按照每孔105個(gè)細(xì)胞密度種植于96孔細(xì)胞板上，置于含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO 2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，加入濃度為5 g/L的MTT溶液20 μL孵育4 h。再以200 μL二甲基亞砜孵育20 min使藍(lán)紫色結(jié)晶完全溶解。使用酶標(biāo)儀檢測各組細(xì)胞在490 nm波長處的吸光度（A）值。細(xì)胞存活率=（實(shí)驗(yàn)組A值-空白組A值）/（對照組A值-空白組A組）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率 收集處理結(jié)束后的各組細(xì)胞，參照細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書步驟，上流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 ELISA法檢測細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-6和TNF-α含量 收集處理結(jié)束后的各組細(xì)胞上清液，參照ELISA試劑盒說明書步驟檢測細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-6和TNF-α含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 比色法檢測細(xì)胞LDH漏出率 收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，根據(jù)LDH試劑盒說明書步驟分別檢測培養(yǎng)液和細(xì)胞內(nèi)的LDH活性。LDH漏出率=培養(yǎng)液中LDH活性/（細(xì)胞內(nèi)LDH活性+培養(yǎng)液中LDH活性）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.6 Western blot檢測細(xì)胞中HMGB1、Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá) 在冰上向收集到的各組細(xì)胞中加入RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白，以BCA定量法檢測蛋白的濃度。在SDS-RIPA凝膠電泳分離后，電轉(zhuǎn)至PVDF膜上。將膜置于含50 g/L脫脂奶粉的TBST液中處理1 h后，加入使用TBST稀釋的HMGB1抗體（1∶1 000）、Bax抗體（1∶500）、Bcl-2抗體（1∶500）、Cleaved caspase-3抗體（1∶1 000）、β-actin抗體（1∶1 000）于4 ℃下結(jié)合反應(yīng)24 h，再以TBST稀釋的二抗（1∶2 000，辣根過氧化酶標(biāo)記）室溫孵育1.5 h。蛋白條帶在Quantity One軟件中進(jìn)行半定量分析，以β-actin為內(nèi)參照。 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s形式表示，多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗(yàn);兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞中的HMGB1蛋白表達(dá)和上清液中HMGB1、IL-1β及TNF-α含量比較

與對照組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)HMGB1蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α含量均顯著升高（F=171.199～391.008，q=28.058～49.269，P均lt;0.01）;與模型組相比，模型+丙泊酚組細(xì)胞內(nèi)HMGB1蛋白的表達(dá)水平以及HMGB1、IL-1β和TNF-α的含量均顯著降低（q=22.531～35.032，Plt;0.01）;與模型+丙泊酚組比較，模型+丙泊酚+HMGB1組細(xì)胞內(nèi)HMGB1蛋白的表達(dá)水平以及HMGB1、IL-1β和TNF-α的含量均顯著升高（q=14.811～23.987，P均lt;0.01），而模型+丙泊酚+空載體組中則沒有見顯著改變（Pgt;0.05）。見圖1和表1。

2.2 各組細(xì)胞存活率和LDH漏出率的比較

與對照組相比，模型組細(xì)胞存活率顯著降低，而LDH漏出率顯著升高（F=167.790、349.324，q=33.505、47.940，P均lt;0.01）;與模型組相比，模型+丙泊酚組細(xì)胞存活率顯著升高，而LDH漏出率顯著降低（q=21.751、24.714，P均lt;0.01）;與模型+丙泊酚組相比較，模型+丙泊酚+空載體組細(xì)胞存活率和LDH漏出率均未見顯著改變（Pgt;0.05），但模型+丙泊酚+HMGB1組細(xì)胞存活率顯著降低，而LDH漏出率顯著升高（q=13.038、17.792，Plt;0.01）。見表2。

2.3 各組細(xì)胞凋亡率的比較

對照組、模型組、模型+丙泊酚組、模型+丙泊酚+空載體組和模型+丙泊酚+HMGB1組的細(xì)胞凋亡率分別為（2.16±1.02）%、（32.25±2.36）%、（13.58±1.12）%、（12.16±1.05）%和（23.85±1.37）%，多組間比較差異有顯著性（F=184.887，P<0.05）。與對照組比較，模型組細(xì)胞凋亡率顯著升高（q=35.390，Plt;0.05）;與模型組比較，模型+丙泊酚組細(xì)胞凋亡率顯著降低（q=21.958，Plt;0.05）;與模型+丙泊酚組相比較，模型+丙泊酚+HMGB1組凋亡率顯著升高（q=12.079，Plt;0.05），而模型+丙泊酚+空載體組凋亡率未見顯著改變（Pgt;0.05）。見圖2。

2.4 各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3的比較

與對照組相比，模型組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平降低，而Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高（F=81.619～165.223， q=24.398～33.331，P均lt;0.05）;與模型組相比，模型+丙泊酚組Bcl-2蛋白表達(dá)升高，而Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著降低（q=11.711～18.974，P均lt;0.05）;與模型+丙泊酚組相比，模型+丙泊酚+HMGB1組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，而Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平顯著升高（q=5.885～13.703，P均lt;0.01）;但是，模型+丙泊酚+空載體組與模型+丙泊酚組相比較，細(xì)胞Bcl-2、Bax和Cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平差異無顯著性（Pgt;0.05）。見圖3和表3。

3 討論

HMGB1通常位于細(xì)胞核內(nèi)，可被主動(dòng)或被動(dòng)釋放到胞外，而胞外的HMGB1可通過與許多因子或受體作用，影響核轉(zhuǎn)錄因子-κB的活性，進(jìn)而在免疫調(diào)節(jié)、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖和細(xì)胞凋亡等過程中發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用[13]。HMGB1可加重缺血損傷，而靶向抑制HMGB1被認(rèn)為是臨床預(yù)防腦缺血損傷的重要策略[14-15]。本研究在構(gòu)建的糖氧剝奪再灌注損傷星形膠質(zhì)細(xì)胞模型中顯示，HMGB1表達(dá)升高;同時(shí)，促炎因子IL-1β和TNF-α表達(dá)升高，星形膠質(zhì)細(xì)胞存活率降低，凋亡率升高，促凋亡蛋白Bax和凋亡執(zhí)行蛋白Cleaved caspase-3表達(dá)升高，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低。李滿等[12]研究指出，糖氧剝奪/復(fù)氧后釋放的HMGB1可通過調(diào)控Bcl-2和Bax的表達(dá)促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷和凋亡。本研究結(jié)果與其類似，提示HMGB1在糖氧剝奪再灌注損傷的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。

丙泊酚在抗炎和保護(hù)腦組織損傷方面發(fā)揮著重要作用[16-17]。劉波等[18]研究顯示，低劑量的丙泊酚可通過抑制炎癥反應(yīng)改善腦缺血再灌注損傷。顧新宇等[19]研究證實(shí)，丙泊酚可激活ERK信號通路提高原代海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞活力，在丙泊酚鎮(zhèn)靜過程中維持腦穩(wěn)態(tài)。陸瑜等[20]發(fā)現(xiàn)，丙泊酚可通過抑制miR-181a并增強(qiáng)抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)對乏糖培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用。本研究結(jié)果也表明，丙泊酚對糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的活性降低、炎癥反應(yīng)加重和細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)等現(xiàn)象均有明顯改善作用。同時(shí)，丙泊酚還可引起HMGB1表達(dá)降低。而WANG等[21]研究表明，丙泊酚可通過抑制脂多糖誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)和釋放在膿毒癥病人中起保護(hù)作用。張明曉等[10]研究證實(shí)，丙泊酚可通過激活p38 MAPK信號通路抑制TNF-α誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞HMGB1表達(dá)，影響腦損傷晚期炎癥反應(yīng)。提示HMGB1在丙泊酚保護(hù)糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷過程中發(fā)揮著重要作用。為了證實(shí)這一推測，本研究通過上調(diào)HMGB1蛋白的表達(dá)顯示，丙泊酚對糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用明顯逆轉(zhuǎn)。說明丙泊酚可能通過下調(diào)HMGB1發(fā)揮保護(hù)糖氧剝奪再灌注誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞損傷。

綜上所述，丙泊酚可以通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡和炎癥反應(yīng)改善糖氧剝奪再灌注損傷，而HMGB1表達(dá)下調(diào)是該保護(hù)過程的重要機(jī)制。該結(jié)果進(jìn)一步豐富了丙泊酚保護(hù)腦缺血損傷的分子機(jī)制，但丙泊酚是如何從通路分子水平抑制HMGB1表達(dá)還有待進(jìn)一步深入研究。

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（本文編輯 于國藝）