超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜法同時測定血清中12種全氟化合物

王錚，張濟明，郭劍秋，張磊，戴一鳴，鄔春華，周志俊

復旦大學 a.公共衛(wèi)生學院 b.教育部公共衛(wèi)生安全重點實驗室，上海 200032

全氟化合物（perfluoroalkyl substances，PFAS）是一類人工合成的有機物，因其碳鏈上所有氫原子被氟原子取代而得名。PFAS 具有親水親脂性、高表面活性、化學穩(wěn)定性和熱穩(wěn)定性好等特點，被廣泛用于制造不粘鍋、消防泡沫、食品包裝防油涂層和衣物的防水涂層等，也隨之進入環(huán)境并造成了人群廣泛暴露，常見的PFAS 包括全氟羧酸類化合物（如全氟辛酸）及全氟磺酸類化合物（如全氟辛基磺酸）等［1］。研究表明，PFAS 暴露可能與多種不良健康效應(yīng)如低出生體重、肥胖、甲狀腺功能紊亂等有關(guān)［2］，因此有必要對人群PFAS 暴露負荷進行監(jiān)測。然而目前PFAS 的檢測方法大多局限于環(huán)境樣品，有關(guān)生物樣品中PFAS的檢測方法較少，所以建立快速準確的定量檢測生物樣品中多種PFAS 的方法，對監(jiān)測人群PFAS 暴露水平，進而評估其暴露風險和可能的健康效應(yīng)具有重要意義。

目前常見PFAS 的分析方法主要包括色譜法和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等，其中液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法無須衍生，結(jié)合固相萃?。╯olid phase extraction，SPE）［3］、加速溶劑萃?。?］等預處理技術(shù)，可使得血液中PFAS 的檢出限低至ng·L-1水平，是檢測生物樣本中PFAS 濃度的首選方法。本研究選取文獻報道的環(huán)境［5］及人體暴露［6］中具有代表性的6 種全氟羧酸類化合物（全氟庚酸、全氟辛酸、全氟壬酸、全氟癸酸、全氟十一烷酸、全氟十二烷酸）、5 種全氟磺酸類化合物（全氟丁基磺酸、全氟己基磺酸、全氟庚基磺酸、全氟辛基磺酸、全氟癸基磺酸）以及1 種全氟磺酰胺類化合物（全氟辛基磺酰胺），通過酶水解、乙腈沉淀蛋白和SPE 等方法對血清樣品中的目標物進行提取、凈化和富集，應(yīng)用超高效液相色譜-四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatographyquadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry，UPLC-Q-Orbitrap HRMS）建立快速準確同時檢測血清中12 種PFAS 的方法，以實現(xiàn)生物監(jiān)測中大樣本分析的需要，為PFAS 的暴露評估和相關(guān)研究的開展提供技術(shù)支撐，12種PFAS 的結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 12種PFAS 的化學結(jié)構(gòu)式Figure 1 Structural formula of 12 PFAS

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Ultimate 3000超高效液相色譜串聯(lián)Q-Exactive?四極桿/靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)（ThermoFisher，美國）；SpeedVac SPD1030真空濃縮儀（ThermoFisher，美國）；Hypersil GOLD C18 色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，ThermoFisher，美國）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（Merck，德國）；Oasis HLB SPE柱（30 mg，1 mL，Waters，美國）；Supelclean ENVI-18 SPE柱（100 mg，1 mL，Sigma-Aldrich，美國）；ProElut PLS SPE柱（30 mg，1 mL，Dikma，中國）。

12 種PFAS 標準品：全氟庚酸、全氟辛酸、全氟壬酸、全氟癸酸、全氟十一烷酸、全氟十二烷酸、全氟丁基磺酸、全氟辛基磺酸（純度分別為99%、分析純、分析純、98%、96%、分析純、97%、96.4%，Sigma-Aldrich，美國），全氟己基磺酸（分析純，Apollo Scientific，英國），全氟庚基磺酸、全氟辛基磺酰胺（純度分別為95.3%和96.0%，Dr.Ehrenstorfer GmbH，德國），全氟癸基磺酸（分析純，Chiron AS，挪威）；2 種PFAS 同位素內(nèi)標：13C8-全氟辛酸和13C8-全氟辛基磺酸（純度均為99%，Cambridge Isotope Laboratories，美國）；β-葡萄糖醛酸酶（Sigma-Aldrich，美國）；乙酸-乙酸銨緩沖液（pH=5，廈門海標科技有限公司，中國）；胎牛血清（Sigma-Aldrich，美國）；甲醇、乙腈、異丙醇、乙酸及乙酸銨（色譜級，Sigma-Aldrich，美國）。

12種目標物的定量離子和質(zhì)荷比如表1所示。

表1 12種目標物的定量離子和質(zhì)荷比Table 1 Quantitative ions and mass-to-charge ratios of 12 analytes

1.2 標準溶液、校準曲線及質(zhì)控樣品的配制

將12種標準品和2種同位素內(nèi)標用甲醇配制成質(zhì)量濃度（后簡稱，濃度）為10 mg·L-1的單標儲備液，置于-20℃冰箱保存。標準儲備液用甲醇稀釋成2 mg·L-1的工作液。分別取一定量各標準工作液和內(nèi)標工作液，用甲醇稀釋成0.1 mg·L-1的混標溶液和0.1 mg·L-1的內(nèi)標混合液，置于4℃冰箱保存。

用50%（體積分數(shù)）甲醇溶液稀釋混標溶液，配制含10 個濃度水平（0、0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 μg·L-1）的標準曲線（其中全氟庚酸和全氟辛基磺酸實際納入標準曲線計算的為8 個濃度水平，不含0.01 μg·L-1和0.05 μg·L-1；全氟癸基磺酸和全氟辛基磺酰胺實際納入標準曲線計算的為9 個濃度水平，不含0.01 μg·L-1）。在胎牛血清中加入混標溶液，配制與標準曲線相同濃度水平的工作曲線及低、中、高3 個濃度（0.20、1.00、5.00 μg·L-1）的質(zhì)控樣品，置于4℃冰箱保存。

1.3 樣品預處理

將源自某出生隊列研究對象的臍帶血清樣品［項目獲得復旦大學公共衛(wèi)生學院倫理委員會批準（批準號：IRB#2016-12-0607），取樣時均征得孕婦及家屬知情同意］從-80℃冰箱中取出，室溫解凍。震蕩混勻后取200 μL 樣品置于1.5 mL 尖底離心管，隨后依次加入0.1 mg·L-1同位素內(nèi)標10 μL，pH=5.0 的乙酸-乙酸銨緩沖溶液100 μL，β-葡萄糖醛酸酶15 μL，漩渦混勻后于37℃水浴6 h。冷卻至室溫后加入200 μL 乙腈漩渦混勻，在4℃下以21 380×g離心10 min。取上清液上樣于經(jīng)1 mL 甲醇和1 mL 超純水活化后的SPE 柱，再用1 mL超純水和1 mL 淋洗液淋洗，最后用2 mL 洗脫液洗脫。分別比較應(yīng)用3種SPE 柱（ProElut PLS 柱、Oasis HLB 柱和Supelclean ENVI-18 柱）、4 種不同比例甲醇淋洗液（體積分數(shù)分別為10%、30%、50%和70%）和3 種洗脫液（甲醇、乙腈和異丙醇）對SPE 回收率的影響，優(yōu)化SPE 條件。收集洗脫液置于真空濃縮儀，濃縮2 h 至近干。加入200 μL 甲醇-水溶液（1 ∶1，體積比）復溶，漩渦混勻后移至進樣小瓶，待測。

1.4 儀器條件

色譜分析條件如下。色譜柱：Thermo Hypersil GOLD C18柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；柱溫：40℃；流速：0.4 mL·min-1；進樣量10 μL；流動相：分別考察3 種流動相體系，水溶液（A）-甲醇溶液（B）、含1 mmol·L-1乙酸銨的水溶液（A）-含1 mmol·L-1乙酸銨的甲醇溶液（B）和含5 mmol·L-1乙酸銨的水溶液（A）-含5 mmol·L-1乙酸銨的甲醇溶液（B）。在混合器和進樣環(huán)之間增加1 根色譜柱（Thermo Hypersil GOLD C18柱，100 mm×2.1 mm，1.9 μm）。流動相梯度洗脫程序為0～1 min，5% B；1～2 min，5%～30% B；2～6 min，30%～90% B；6～7 min，90%～100% B；7～8 min，100%～5% B；8～10 min，5% B。

質(zhì)譜分析條件如下。加熱電噴霧離子源：負離子模式監(jiān)測；離子傳輸管溫度：320℃；噴霧電壓：-3.0 kV；鞘氣流速：40 arb（Thermo 質(zhì)譜任意單位，僅適用于Thermo 質(zhì)譜，后同）；輔助氣流速：15 arb；輔助氣溫度：300℃；掃描方式：全掃描；掃描范圍（質(zhì)荷比）：150～1 000；分辨率：70 000（半峰寬）；C-trap容量（AGC target）：3×106；C-trap 注入時間：200 ms。

2 結(jié)果

2.1 SPE條件的確定

如表2所示，本研究以空白加標樣品和標準品響應(yīng)的比值計算絕對回收率。比較了10 μg·L-1空白加標樣品經(jīng)Supelclean ENVI-18 SPE柱、ProElut PLS SPE柱和Oasis HLB SPE柱預處理后的回收率，發(fā)現(xiàn)Oasis HLB SPE柱對長鏈和中長鏈PFAS都具有較好的保留，除全氟庚酸外絕對回收率均超過50%，因此實驗最終選用Oasis HLB SPE柱。本研究還考察了四種不同比例的甲醇淋洗液對Oasis HLB SPE柱回收率的影響，用10%和30%（體積分數(shù)）的甲醇淋洗后用異丙醇洗脫回收率為39%～103%，用50%（體積分數(shù)）甲醇淋洗時短鏈PFAS 如全氟庚酸和全氟丁基磺酸基本無回收，而用70%（體積分數(shù)）甲醇淋洗時除全氟癸基磺酸和全氟辛基磺酰胺外的目標物都幾乎不回收，因此本研究最終選用30%（體積分數(shù)）甲醇作為淋洗液。實驗還發(fā)現(xiàn)以30%（體積分數(shù)）的甲醇淋洗Oasis HLB SPE 柱后應(yīng)用乙腈、甲醇和異丙醇三種不同極性的洗脫液均有較好的絕對回收率，因此選擇了急性毒性較小的異丙醇作為洗脫液。

表2 不同SPE條件對絕對回收率的影響Table 2 Absolute recovery rates under various SPE conditions單位（Unit）：%

2.2 色譜條件的確定

本實驗選用Thermo Hypersil GOLD C18色譜柱進行目標物的分離，考察3種不同的流動相體系（水-甲醇、含1 mmol·L-1乙酸銨的水-甲醇以及含5 mmol·L-1乙酸銨的水-甲醇），實驗表明應(yīng)用含5 mmol·L-1乙酸銨的水-甲醇體系做流動相時，目標物在色譜柱上分離較好，峰形對稱，如圖2所示。

圖2 質(zhì)控樣品12種PFAS 及2 種同位素內(nèi)標的提取離子流圖Figure 2 Extracted ion chromatogram of 12 PFAS and 2 isotopeinternal standards in quality control samples

2.3 背景值的消除

應(yīng)用預分離色譜柱分離背景干擾與樣品中的目標物。以全氟庚酸為例，在進樣全氟庚酸標準溶液后，樣品中全氟庚酸峰與儀器析出的全氟庚酸峰完全分離，如圖3所示。

2.4 校準曲線和定量限

以13C8-全氟辛酸作為全氟羧酸類化合物的內(nèi)標，13C8-全氟辛基磺酸作為全氟磺酸類及全氟磺酰胺類化合物的內(nèi)標，以目標化合物濃度為橫坐標，目標化合物峰面積與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標繪制標準曲線，各目標物標準曲線線性良好。以同樣方法繪制工作曲線，全氟庚酸和全氟辛基磺酸的線性范圍為0.10～10.00 μg·L-1，全氟癸基磺酸和全氟辛基磺酰胺的線性范圍為0.05～10.00 μg·L-1，其余8 種待測目標物的工作曲線線性范圍均為0.01～10.00 μg·L-1，相關(guān)系數(shù)r均大于0.996。以10 倍信噪比濃度定義方法定量限（limit of quantitation，LOQ），12 種PFAS 的工作曲線及LOQ 如表3所示。

圖3 改進前（A）、后（B）0.5 μg·L-1樣品中全氟庚酸的提取離子流圖Figure 3 Extracted ion chromatograms of perfluoroheptanoic acid before (A) and after (B) modification in 0.5 μg·L-1 standard sample

表3 血清中12 種PFAS的工作曲線、相關(guān)系數(shù)和定量限Table 3 Working curve,correlation coefficient,and limit of quantification of 12 PFAS in serum

2.5 精密度和準確度

以空白樣品加標回收率表示方法的準確度，以相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）表示方法的精密度。對低、中、高三個濃度（0.2、1.0、5.0 μg·L-1）的質(zhì)控樣品進行預處理和分析，每一個濃度水平進行5 次平行測定，計算各目標物的加標回收率和日內(nèi)精密度。連續(xù)3 d 重復上述操作，計算各目標物的日間精密度。目標化合物平均回收率在81.0%～123.7%之間，日內(nèi)RSD 在1.2%～14.8%之間，日間RSD 在0.4%～16.1%之間。12 種PFAS 的平均回收率及日內(nèi)和日間RSD 見表4。結(jié)果顯示本方法回收率高，精密度良好，可以用于血清中12種PFAS的準確定量。

表4 3 種質(zhì)量濃度質(zhì)控樣品檢測方法的準確度和精密度（n=5）Table 4 Accuracy and precision of established method in quality control samples at different concentrations (n=5)單位（Unit）：%

2.6 實際樣品分析

應(yīng)用本方法，檢測了20份新生兒臍帶血清中12種PFAS濃度，結(jié)果如表5所示，低于定量限的值以根號二分之定量限計算。PFAS在所有樣品中均有檢出，濃度變異較大，不同PFAS的檢出率不同，除全氟癸基磺酸和全氟辛基磺酰胺的檢出率低于20%外，其他10種PFAS的檢出率≥90%。全氟辛酸和全氟辛基磺酸是檢出濃度最高的兩種PFAS，中位數(shù)分別為3.53 μg·L-1和2.03 μg·L-1。

表5 20 份臍帶血樣品中12種PFAS 檢出率及質(zhì)量濃度分布Table 5 Distribution of 12 PFAS positive rates and concentrations in 20 cord blood serum samples

3 討論

本研究通過對血清樣品預處理和儀器分析條件的優(yōu)化，同時通過增加預分離色譜柱消除儀器背景干擾，建立了基于UPLC-Q-Orbitrap HRMS 技術(shù)的快速、準確、同時測定血清中12 種PFAS 濃度的方法，方法定量限為0.01～0.10 μg·L-1，12 種目標物平均回收率在81.0%～123.7%之間，日內(nèi)和日間RSD 分別為1.2%～14.8%和0.4%～16.1%。將方法應(yīng)用于新生兒臍帶血清樣本的檢測，PFAS 在所有樣品中均有檢出，此方法可以滿足日常檢測的需要。

由于血清樣品基質(zhì)復雜，PFAS 含量低微，對目標物提取和富集是樣品預處理的重要環(huán)節(jié)。PFAS 易與血清中的白蛋白結(jié)合而在血液中蓄積［7］，因此實驗采用β-葡萄糖醛酸酶水解結(jié)合態(tài)PFAS，加入乙腈振蕩離心以沉淀蛋白后再經(jīng)SPE 柱提取凈化。SPE 技術(shù)具有溶劑用量少、分離效果好、操作簡便重現(xiàn)性好等優(yōu)點，然而不同SPE 柱的品牌及填料類型、淋洗溶劑及洗脫溶劑等條件對SPE 的回收率有較大影響。相較于C18柱（Supelclean ENVI-18 SPE 柱），親水親脂柱（ProElut PLS SPE柱和Oasis HLB SPE柱）對PFAS的保留能力更好。隨著淋洗液中甲醇比例的增加，淋洗液的洗脫能力增強，50%和70%（體積分數(shù)）甲醇淋洗液的洗脫能力過強，會將PFAS從SPE柱上洗脫，造成較低的絕對回收率。

色譜柱和流動相的選擇是分離復雜基質(zhì)中多種目標物的關(guān)鍵。PFAS 作為一類極性物質(zhì)，本研究根據(jù)文獻報道選擇了最常用的C18反相色譜柱，以水-甲醇流動相體系進行分離。考慮到本研究主要檢測的目標物為羧酸及磺酸類物質(zhì)，添加緩沖鹽可以有效地調(diào)節(jié)流動相pH，抑制目標物解離，改善峰形，因此在流動相體系中加入一定量的乙酸銨調(diào)節(jié)流動相pH 和離子濃度。

低背景值是獲得準確定量的前提條件，由于PFAS具有親水親脂性和高表面活性，其多聚物如聚四氟乙烯常被用于液相色譜管路的制作，既有研究表明PFAS在儀器空白中有較高檢出［8］。與孫瑞［9］的報道相似，本研究儀器的背景值主要為泵前聚四氟乙烯管路中析出的全氟辛酸和全氟庚酸。為解決這一問題，參照現(xiàn)有研究［10］在混合器和進樣環(huán)之間增加一根色譜柱，使得泵前析出的PFAS在前端色譜柱上先進行分離，使儀器析出的PFAS 的出峰時間相比實際樣品中PFAS 出峰時間延長，成功實現(xiàn)對目標物的分離并準確定量。

UPLC-Q-Orbitrap HRMS 作為近年來新研發(fā)的高分辨率質(zhì)譜，以其優(yōu)越的性能被廣泛用于定性檢測，同時其在定量分析上也有較好的表現(xiàn)［11］。研究顯示在定量檢測如PFAS 等痕量化學物質(zhì)時，Orbitrap 高分辨率質(zhì)譜與三重四極桿質(zhì)譜相比，檢出限、精密度和準確度相近［12］。本方法與現(xiàn)有方法［13-15］相比，具有定量限低、樣品用量少、分析時間短等優(yōu)點，應(yīng)用本方法在20 份臍帶血樣本中均檢出了PFAS，大部分目標物的檢出率為100%，可滿足大樣本生物監(jiān)測中快速、準確、同時測定血清中多種PFAS 的實際需求。