春尺蠖細(xì)胞色素C氧化酶亞基I基因的克隆與系統(tǒng)進(jìn)化分析*

陳龍 崔闊澍 單艷敏 查干

1.河套學(xué)院農(nóng)學(xué)系，內(nèi)蒙古巴彥淖爾

2.四川省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，四川成都

3.內(nèi)蒙古自治區(qū)草原工作站，內(nèi)蒙古巴彥淖爾

4.巴彥淖爾市草原工作站，內(nèi)蒙古巴彥淖爾

春尺蠖Apocheima cinerarius Ershoff，又稱春尺蛾，是一種鱗翅目、尺蛾科雜食性害蟲，被我國(guó)多個(gè)省、自治區(qū)列為重點(diǎn)監(jiān)測(cè)范圍，具有繁殖成活率高、蛹羽化速度快、多食性、暴食性等特點(diǎn)[1-2]。近年來，春尺蠖主要危害范圍呈擴(kuò)大趨勢(shì)，危害對(duì)象從桑、梨等20余種林木逐步發(fā)展到玉米、小麥等農(nóng)作物，危害部位多為葉片，危害區(qū)域從內(nèi)蒙古、新疆、黃淮海等北方區(qū)域逐步向四川、云南等南方區(qū)域爆發(fā)遷移。本研究對(duì)春尺蠖遺傳規(guī)律進(jìn)行了分析，進(jìn)一步探明了春尺蠖在昆蟲綱Insecta進(jìn)化樹中的位置及其進(jìn)化規(guī)律，不僅具有分子遺傳學(xué)價(jià)值，而且具有預(yù)期防治意義。

細(xì)胞色素C氧化酶亞基Ⅰ（COⅠ）是線粒體DNA（mtDNA）中最保守的蛋白，是動(dòng)物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析的條形碼[3]，其序列已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于膜翅目昆蟲蜜蜂[4]、鱗翅目[5，6]、雙翅目果蠅[7]等昆蟲種間的分子鑒定和系統(tǒng)發(fā)育研究。目前研究表明，線粒體遺傳密碼與基因組遺傳密碼相比較，不僅具有高度的相似性，且更能代表遺傳密碼的早期形式[8]，因此，利用COⅠ基因作為分子標(biāo)記來分析種群的遺傳結(jié)構(gòu)和變異，可從分子學(xué)角度為春尺蠖的鑒定分類和系統(tǒng)進(jìn)化提供可靠的依據(jù)[9]。雖然Liu等[10]在NCBI中已上傳春尺蠖線粒體基因組序列并分析了其全基因序列，但還未見關(guān)于COⅠ基因的序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系相關(guān)的報(bào)道。本研究克隆獲取了春尺蠖COⅠ基因序列，并對(duì)春尺蠖線粒體基因組COⅠ基因進(jìn)行了序列分析，明確了其分子遺傳特征，對(duì)其蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行了分析，預(yù)測(cè)了其編碼蛋白的分子結(jié)構(gòu)，提出了春尺蠖與近源主要類群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，為明確春尺蠖在鱗翅目昆蟲的分類地位及分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，以及春尺蠖種群分布與進(jìn)化關(guān)系的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試?yán)ハx：內(nèi)蒙古巴彥淖爾市烏拉特前旗檸條草場(chǎng)(E:108°45′ 23.63″ ; N: 40°46′ 4.19″ )的春尺蠖雌雄成蟲。 主要試劑： TaKaRa MiniBEST Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.5.0、TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0、連接載體pMD19-T Vector Cloning Kit、2×PCR Master Mix 及 TaKaRa Taq 購(gòu)自大連 TaKaRa 公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京天根(Tiangen)公司。

1.2 DNA 提取

將春尺蠖雌雄成蟲各取3 只混合后，置于滅菌后的研缽中用液氮研磨，具體提取步驟參照TaKaRa DNA 提取試劑盒說明書。而后利用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳與Nano Photometer?P-Class 超微量分光光度計(jì)分別檢測(cè)提取DNA 的質(zhì)量和濃度。

1.3 COⅠ基因序列克隆

由于COⅠ基因內(nèi)部含AT 序列富集區(qū)，所以利用Primer Premier 5.0 軟件在COⅠ基因外圍設(shè)計(jì)RT-PCR擴(kuò)增引物的方法來擴(kuò)增春尺蠖COⅠ基因的全序列。上游引物 COⅠ-F: 5′ -ATAAAAGAGAAATATTCCC GTAAAT-3′；下游引物 COⅠ-R: 5′ -ATAGTCTGC CATATTAGAAGTTTCT-3′。PCR 反應(yīng)體系共 25 μL（擴(kuò)增模板1 μL，上下游引物各1 μL，Master Mix 12.5 μL，RNase-free Water 9.5 μL）。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性 94 ℃、5 min；94 ℃、30 s，56 ℃、30 s，72 ℃、1 min 30 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。利用1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物，而后經(jīng)回收、亞克隆送北京六合華大公司測(cè)序。

1.4 春尺蠖COⅠ基因的生物信息學(xué)分析

利用在線預(yù)測(cè)網(wǎng)站ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè)基因蛋白編碼序列；使用ExPASy - ProtParam tool （http://web.expasy.org /protparam/）預(yù)測(cè)春尺蠖COⅠ編碼氨基酸的基本理化性質(zhì)，利用DNAMAN V6.0（Lynnon Biosoft，加拿大）分析COⅠ基因編碼氨基酸的同源性和遺傳距離；應(yīng)用SignalIP5.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/） 預(yù)測(cè)COⅠ基因編碼的氨基酸N 端信號(hào)肽；用TMHMM（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）預(yù)測(cè)蛋白跨膜區(qū)域；用SWISS-MODEL 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)；用MEGA6.0 中的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，采用p距離（P-distance） 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 春尺蠖COⅠ基因的克隆

根據(jù)NCBI 中已上傳的春尺蠖CO Ⅰ基因序列信息，以COⅠ-F 和COⅠ-R為引物在目的基因外圍擴(kuò)增1 621 bp 的片段，經(jīng)1%濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)發(fā)現(xiàn)有一條1 600 bp 左右的特異性條帶，測(cè)序后發(fā)現(xiàn)其包含的1 531 bp 序列與春尺蠖線粒體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中該基因的序列比對(duì)一致。

2.2 春尺蠖COⅠ蛋白的理化性質(zhì)

春尺蠖COⅠ基因全長(zhǎng)1 531 bp，編碼蛋白區(qū)以CGA 作為起始，以堿基T 作為不完全終止，其中，A、T、 C、 G 的含量分別為 32.6%、 39.2%、 14.0%、14.2%，C+G 含量為28.2%，A+T 含量為71.8%，符合動(dòng)物線粒體基因序列特征。

在COⅠ蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果中顯示，該蛋白的預(yù)測(cè)分子式為C2660H4021N623O685S29，共包含510 個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子量為56.62 kD，等電點(diǎn)為5.92；半衰期和脂肪指數(shù)分別為1 h、113.96，負(fù)電荷殘基（Asp + Glu）總電荷的24 高于正電荷殘基（Arg+ Lys）總電荷的15；該蛋白的親水性為0.705，為疏水性蛋白。不穩(wěn)定系數(shù)為34.62，小于參考值40.00，故COⅠ為穩(wěn)定蛋白。SignalP 5.0 Server 預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，COⅠ在N端不含信號(hào)肽（信號(hào)肽預(yù)測(cè)見圖1）；通過預(yù)測(cè)該蛋白的跨膜區(qū)和三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，COⅠ蛋白含12個(gè)跨膜區(qū)（跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)見圖2），而三維結(jié)構(gòu)模型（圖3）中絕大部分為α 螺旋，數(shù)量與圖2 跨膜區(qū)一致。

2.3 春尺蠖COⅠ基因的同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析

將春尺蠖COⅠ基因的氨基酸序列與NCBI 中搜索得到的其它昆蟲序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明春尺蠖COⅠ基因氨基酸序列與其它昆蟲的序列有很高的一致性，均高于93.00%。與同為鱗翅目尺蠖蛾科的茶尺蠖COⅠ和同為鱗翅目的草地貪夜蛾COⅠ氨基酸序列一致性最高（95.69%），其次為草地螟COⅠ和菜粉蝶COⅠ，一致性分別為95.29%和93.14%。

圖1 春尺蠖CO I基因編碼蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)圖

圖2 春尺蠖CO I基因編碼蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖3 春尺蠖CO I蛋白三維結(jié)構(gòu)模型

通過NCBI 搜索其他目昆蟲已上傳的COⅠ的氨基酸序列與春尺蠖COⅠ序列信息結(jié)合構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，進(jìn)化樹中的鱗翅目、鞘翅目、雙翅目和膜翅目分別聚在不同分支上；在鱗翅目分支上春尺蠖COⅠ與同為鱗翅目尺蠖蛾科的茶尺蠖COⅠ聚為一類，二者親緣關(guān)系最近，遺傳距離為0.022（表1）；與鞘翅目、雙翅目和膜翅目昆蟲的親緣關(guān)系依次變遠(yuǎn)，遺傳距離范圍在0.042～0.080 之間。這表明COⅠ基因在鱗翅目和其它目昆蟲中具有相對(duì)保守的進(jìn)化關(guān)系，與諸多有關(guān)鱗翅目DNA條形碼研究的結(jié)論一致。

3 討論

3.1 春尺蠖COⅠ基因信息特征分析

雖然，鱗翅目昆蟲種類超過18 萬種，遺傳規(guī)律復(fù)雜多變，但有研究表明鱗翅目昆蟲mtDNA 具有顯著的堿基偏倚性。如Liao 等[11]在對(duì)鱗翅目多種昆蟲的研究中發(fā)現(xiàn)，平均A+T 含量在77.0%以上，在基因編碼控制區(qū)可達(dá)90.0%以上。楊兆富[12]等對(duì)草螟科野螟亞科的總COⅠ基因研究中發(fā)現(xiàn)，野螟亞科COⅠ基因A+T 含量為70.0%。呼曉慶[13]等對(duì)鱗翅目昆蟲中國(guó)草地螟的研究中發(fā)現(xiàn)，中國(guó)草地螟COⅠ基因長(zhǎng)度為658 bp，A+T含量為70.6%。除鱗翅目昆蟲外，在鞘翅目昆蟲茄十二星瓢蟲和赤擬谷盜的COⅠ基因中也有相同的特征[14]。 本 研 究 克 隆 獲 得 的 春 尺 蠖COⅠ基因全長(zhǎng)為1 531 bp，其中，A、T、C、G的含量分別為32.6%、39.2%、14.0%、14.2%，A+T 含量為71.8%，遠(yuǎn)高于C+G 的含量28.2%，符合昆蟲mtDNA蛋白編碼序列A+T 含量都較高的典型特征[15]。根據(jù)NCBI已有春尺蠖COⅠ基因信息，通過RT-PCR技術(shù)克隆獲得測(cè)序后發(fā)現(xiàn)它包含春尺蠖COⅠ基因，經(jīng)與春尺蠖線粒體基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中該基因的序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)兩者序列一致，結(jié)合該基因的生物信息學(xué)、同源基因序列比對(duì)和后續(xù)系統(tǒng)發(fā)育樹等分析，進(jìn)一步確認(rèn)該基因是COⅠ基因。

表1 鱗翅目昆蟲COⅠ基因遺傳距離

3.2 春尺蠖COⅠ基因與其近緣種起始密碼子、終止密碼子序列的比較

mtDNA 與細(xì)胞核基因相比，其基因結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，共編碼13種蛋白，與其他編碼蛋白相比，COⅠ基因進(jìn)化緩慢，具有較高的保守性，其起始密碼子與終止密碼子也較為特殊，蛋白編碼系統(tǒng)會(huì)因生物不同的進(jìn)化而產(chǎn)生差異，這種差異同樣出現(xiàn)于細(xì)胞核基因和細(xì)胞器內(nèi)[16]。目前，COⅠ基因還未發(fā)現(xiàn)通用的起始密碼子，在已報(bào)道的5 種鱗翅目昆蟲線粒體基因中，除茶尺蠖（起始密碼子為ATG）外，其余4 種昆蟲5’端高度同源，均以CGA 作為起始密碼子[17]。研究發(fā)現(xiàn)，與春尺蠖親緣關(guān)系較近的家蠶[18]、稻縱卷葉螟[19]、米蛾[20]、竹紋枯葉蛾[21]、青黃枯葉蛾[22]和文山松毛蟲23]的COⅠ基因起始密碼子也均為CGA，這可以作為起始密碼子判斷的一個(gè)重要依據(jù)。本研究對(duì)春尺蠖COⅠ基因進(jìn)行測(cè)序，發(fā)現(xiàn)其編碼蛋白區(qū)同樣以CGA 作為起始，這也驗(yàn)證了鱗翅目昆蟲線粒體基因COⅠ基因進(jìn)化緩慢，具有高度保守性這一特性，填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)對(duì)春尺蠖COⅠ基因研究的空白。但即便眾多鱗翅目昆蟲的起始密碼子均為CGA[24]，在多序列比對(duì)的研究中，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，線粒體基因起始密碼子是ATN、GTG 與TTG 等，這表明COⅠ基因雖為mtDNA 中最保守的基因，其起始密碼子序列卻具有復(fù)雜性及多樣性，并非嚴(yán)格的保守單一序列，造成這種現(xiàn)象的原因是什么，CGA 是否為真正的密碼子值得進(jìn)一步深入研究。

長(zhǎng)期以來，無脊椎動(dòng)物線粒體基因終止密碼存在一定爭(zhēng)議性，通常無脊椎動(dòng)物線粒體基因存在兩種形式的終止密碼子，即TAR 和以堿基T 的不完全終止。部分研究學(xué)者提出應(yīng)遵循一些識(shí)別基本原則來對(duì)復(fù)雜的終止密碼子進(jìn)行多項(xiàng)條件比對(duì)后確定。目前，一些研究發(fā)現(xiàn)線粒體基因組在高級(jí)階元系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究中存在堿基替換飽和、長(zhǎng)枝吸引、類長(zhǎng)枝效應(yīng)、位點(diǎn)速率異質(zhì)性和分組策略選擇等問題[25-27]，在本研究序列分析中發(fā)現(xiàn)，春尺蠖COⅠ基因以堿基T的不完全作為翻譯終止，在小蠟螟、大蠟螟與米蛾的基因序列中也有相同的現(xiàn)象[28]。這源于mtDNA 功能與結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)約，這種現(xiàn)象在后生動(dòng)物mtDNA 中普遍存在，這種基因的3’端終止密碼子不完整，一般3’端都與tRNA緊密相連，完整的終止密碼子由其mRNA 轉(zhuǎn)錄后形成的 poly(A)結(jié)構(gòu)來補(bǔ)充完整[29，30]。

3.3 春尺蠖COⅠ基因保守性與親緣分析

上世紀(jì)末，線粒體COⅠ基因首先被應(yīng)用于昆蟲綱的系統(tǒng)發(fā)育研究，此后，陸續(xù)被應(yīng)用于不同階元類群的昆蟲系統(tǒng)發(fā)育分析。已有學(xué)者對(duì)鱗翅目昆蟲及其親緣關(guān)系較近的雙翅目、鞘翅目、膜翅目昆蟲COⅠ基因進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化分析并取得了許多創(chuàng)新性突破。如張永紅[28]等首次預(yù)測(cè)了小蠟螟COⅠ基因編碼信息，并與其他3種螟蛾科昆蟲COⅠ基因編碼區(qū)進(jìn)行了多序列比對(duì)，研究發(fā)現(xiàn)其起始密碼子為CGA，與其遺傳距離較近的大臘螟COⅠ基因起始密碼子TAA 有顯著不同，這一發(fā)現(xiàn)體現(xiàn)了線粒體基因的多態(tài)性和異質(zhì)性；史妍茹[31]等首次測(cè)定了螟蛾總科米蛾及巢蛾總科旋紋潛葉蛾線粒體全基因組序列，并分別進(jìn)行了注釋，預(yù)測(cè)了米蛾及旋紋潛葉蛾tRNA 為典型的三葉草結(jié)構(gòu)，通過分子生物學(xué)驗(yàn)證了該科昆蟲tRNA 的理論結(jié)構(gòu)。本研究通過序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)春尺蠖COⅠ基因的氨基酸序列與其他近源昆蟲相似度高達(dá)93.0%以上，有較高的同源性和一致性，進(jìn)一步驗(yàn)證了春尺蠖COⅠ基因與其他線粒體基因相比具有更好的保守性[32]。在本研究對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹的研究結(jié)果中也發(fā)現(xiàn)了相似的結(jié)果，表明在COⅠ整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化過程中，春尺蠖與同為尺蛾科的茶尺蠖親緣關(guān)系最近，和同為鱗翅目的昆蟲草地貪夜蛾親緣關(guān)系較近，與來自不同目的昆蟲COⅠ基因親緣關(guān)系差異也較為明顯，其中，鱗翅目與鞘翅目親緣關(guān)系最近，其次為雙翅目，與膜翅目的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這與其他昆蟲COⅠ基因的系統(tǒng)進(jìn)化研究中得出的結(jié)果類似。由此說明，COⅠ具有保守性的同時(shí)還具有差異性，從而使得它能在不同物種和不同的生活環(huán)境中不斷提高適應(yīng)性，起到獨(dú)特的生物學(xué)功能。

雖然本文對(duì)春尺蠖COⅠ基因的序列及進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了全面分析，但是還有一些問題有待進(jìn)一步明確。首先，線粒體基因的遺傳信息是典型的母性遺傳，它與細(xì)胞核基因相比基因片段與進(jìn)化程度在分析近緣及種內(nèi)群體的進(jìn)化關(guān)系上更具有先天的優(yōu)勢(shì)，但任何單一基因標(biāo)記都具有優(yōu)勢(shì)和缺陷，種間的遺傳進(jìn)化分析都需要結(jié)合多種分子標(biāo)記去研究，與COⅠ基因相比，線粒體基因組還有其他保守的基因序列（如COⅡ和CYTB 等），將它們用于進(jìn)化分析，所得結(jié)果是否相同。其次，細(xì)胞核基因在不同組織、雌雄蟲體和不同齡期中的表達(dá)是不同的，作為細(xì)胞質(zhì)基因的COⅠ基因是否同它們一樣，有組織、性別及齡期的表達(dá)異特性。第三，在草地貪夜蛾鑒定分子標(biāo)記鑒定中，常結(jié)合核基因組Z 染色體上的磷酸甘油醛異構(gòu)酶基因（Tpi）作為分類措施，在春尺蠖分子鑒定中是否需要其他基因協(xié)同鑒定以區(qū)分不同亞型。以上問題均需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究克隆了春尺蠖COⅠ基因，明確了春尺蠖COⅠ基因氨基酸的理化性質(zhì)及分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，并預(yù)測(cè)了其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型，為研究春尺蠖的起源與演化提供理論基礎(chǔ)。結(jié)果表明，春尺蠖COⅠ基因的蛋白編碼區(qū)以CGA 為起始密碼子，以堿基T 作為不完全終止，基因全長(zhǎng)為1 531 bp，編碼區(qū)包含510 個(gè)氨基酸，其分子量與等電點(diǎn)分別為56.62 kD 和5.92；N 端未發(fā)現(xiàn)信號(hào)肽，具有12 個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)；預(yù)測(cè)分子式為C2660H4021N623O685S29，不穩(wěn)定系數(shù)為34.62，總平均親水系數(shù)為0.705，為疏水性的穩(wěn)定蛋白。遺傳距離結(jié)果發(fā)現(xiàn)，春尺蠖與茶尺蠖遺傳距離最近（為0.022）。同源序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，春尺蠖與茶尺蠖同源性最高，氨基酸一致性為95.7%。