不同大麥品種特異性SSR分子標(biāo)記的篩選

曾 樂(lè)，楊天賜，姚佳延，洪 益，呂 超，郭寶健，許如根

(植物功能基因組學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省作物基因組學(xué)與分子育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心/揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院，江蘇揚(yáng)州 225009)

隨著育種速度的加快和作物種質(zhì)資源鑒定與評(píng)價(jià)工作的深入，作物品種的類(lèi)別和數(shù)量日漸增多，一批綜合性狀優(yōu)良、配合力好的親本在育種中被廣泛應(yīng)用，造成品種的遺傳基礎(chǔ)變窄以及近似品種數(shù)量增加，難以用形態(tài)學(xué)、生理生化等方法準(zhǔn)確鑒定品種的真實(shí)性和純度。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，DNA指紋鑒定技術(shù)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物品種DUS鑒定[1]；簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeats，SSR)分子標(biāo)記技術(shù)于1991年由Moore 等人創(chuàng)立，具有數(shù)量多、多態(tài)性高、重復(fù)性好、突變率低、標(biāo)記共顯性、引物具有通用性等優(yōu)點(diǎn)[2-3]，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)作物品種真實(shí)性鑒定和純度分析[4]。李曉輝等[5,12]利用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建了我國(guó)主要玉米品種的DNA指紋圖譜，用于鑒定玉米雜交種的真實(shí)性；張建華等[6]利用20對(duì)SSR引物構(gòu)建了玉米黃早四的DNA標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜；孟慶長(zhǎng)等[7]從80對(duì)玉米SSR引物中篩選出4對(duì)引物用于準(zhǔn)確鑒定蘇玉20的純度；蘇順宗等[8]篩選出多態(tài)性較高的SSR引物用于水稻品種的真實(shí)性鑒定和純度鑒定；肖小余等[9]采用SSR標(biāo)記構(gòu)建了四川省26個(gè)雜交稻42個(gè)親本的SSR指紋圖譜；辛業(yè)蕓等[10]和時(shí)寬玉等[11]應(yīng)用SSR標(biāo)記成功地構(gòu)建了不同雜交水稻的分子指紋圖譜；Almadanim等[13]僅用6對(duì)SSR引物就區(qū)分了51個(gè)葡萄牙釀酒葡萄品種。Upadhyay等[14]用3對(duì)SSR引物鑒別了21份印度的葡萄砧木材料品種。

大麥?zhǔn)鞘澜缟蟽H次于水稻、小麥、玉米作物的第四大作物，也是我國(guó)的主要禾本科植物之一[15]。作為非主要農(nóng)作物，大麥品種通過(guò)登記即可推廣。為保護(hù)育種者的知識(shí)產(chǎn)權(quán)，防止假冒偽劣種子對(duì)大麥?zhǔn)袌?chǎng)的影響，開(kāi)發(fā)快速、準(zhǔn)確鑒別不同大麥品種的方法顯得十分必要。Russell等[16]利用4對(duì)SSR引物區(qū)分了24個(gè)大麥品種，并鑒別了相同親本的不同基因型大麥品種；Lin等[17]基于4對(duì)SSR引物，建立了17個(gè)大麥品種的等位基因檢索系統(tǒng)，用于大麥品種的真實(shí)性鑒定；張志軍等[18]利用篩選出的6對(duì)多態(tài)性豐富的SSR引物，可有效區(qū)分21個(gè)大麥品種；王艷平等[19]利用篩選出的28對(duì)多態(tài)SSR引物，對(duì)29個(gè)大麥DUS測(cè)試標(biāo)準(zhǔn)品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析和指紋圖譜的構(gòu)建。以上研究表明，SSR技術(shù)可有效用于大麥品種的真實(shí)性鑒定。但由于所用材料的不同，不同研究者所用的SSR引物數(shù)及組合存在差異。隨著大麥品種檢測(cè)數(shù)目和近似品種的增加，少量核心引物組合的鑒定能力降低，有必要對(duì)鑒定大麥品種所需的標(biāo)記數(shù)量、組合做進(jìn)一步研究，以提高鑒別不同大麥品種的能力。本研究利用SSR標(biāo)記對(duì)3類(lèi)不同來(lái)源組的大麥品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，研究鑒別不同來(lái)源組內(nèi)不同品種所需的最少標(biāo)記數(shù)和最佳標(biāo)記數(shù)，為大麥標(biāo)準(zhǔn)品種指紋圖譜庫(kù)的更新及大麥品種真實(shí)性與純度鑒定標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)材料為來(lái)自于國(guó)內(nèi)外的44個(gè)大麥品種(名稱(chēng)及來(lái)源見(jiàn)表1)，依據(jù)各材料來(lái)源差異，將其分為3個(gè)不同來(lái)源組：江浙滬組、國(guó)內(nèi)組和國(guó)際組。江浙滬組主要包括江蘇、浙江、上海3省市育成的沿海冬性啤酒大麥品種，品種相似性最高；國(guó)內(nèi)組品種主要來(lái)自我國(guó)南方冬大麥區(qū)，品種的生態(tài)類(lèi)型差異較大，品種的相似性相對(duì)較大；國(guó)際組品種有5個(gè)品種來(lái)自日本、美國(guó)及匈牙利；其余15個(gè)品種來(lái)自國(guó)內(nèi)南方冬大麥區(qū)，其品種產(chǎn)地生態(tài)類(lèi)型差異較大。3個(gè)組別的劃分是遞進(jìn)的關(guān)系，組別間部分品種相同。

1.2 田間設(shè)計(jì)

將44個(gè)參試大麥品種種植于揚(yáng)州大學(xué)作物遺傳育種試驗(yàn)田和揚(yáng)州大學(xué)七里甸農(nóng)場(chǎng)試驗(yàn)田，每個(gè)試驗(yàn)田每個(gè)品種種植1行，行長(zhǎng)1.2 m，行距0.2 m，每行點(diǎn)播20粒，株距0.06 m，重復(fù)3次。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 大麥DNA的提取

參照Murray等[24]的方法，于大麥2葉1心期，采用CTAB法提取葉片DNA。

1.3.2 SSR引物的篩選

從GrainGenes網(wǎng)站(https://wheat.pw.usda.gov/GG3/)及已發(fā)表文獻(xiàn)[20-23]中查找大麥SSR標(biāo)記，根據(jù)標(biāo)記在染色體上的分布及位置，隨機(jī)選取均勻分布于大麥7條染色體的28個(gè)多態(tài)性較好的SSR標(biāo)記。28個(gè)標(biāo)記中，3個(gè)GBM標(biāo)記系列引物序列由德國(guó)IPK研究所提供，其余標(biāo)記參照GrainGenes網(wǎng)站公布的序列。所有引物由華大基因公司合成，具體信息見(jiàn)表2。

表1 參試大麥品種的編號(hào)、名稱(chēng)及組別Table 1 Number,name and group of 44 barley varieties

1.3.3 PCR擴(kuò)增體系和產(chǎn)物檢測(cè)

PCR反應(yīng)總體積為20 μL，其中10×PCR Buffer 2.0 μL，Mg2+2.0 μL、dNTPs 0.4 μL、ddH2O 10.4 μL、上下游引物3.0 μL、Taq酶0.2 μL，模版DNA 2.0 μL(50 ng·μL-1)。PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min；94 ℃ 45 s，55 ℃(退火溫度因引物而異，以55 ℃為例)45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。采用6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。電泳結(jié)束后參照Karakousis等[25]的銀染法進(jìn)行顯影，具體操作步驟為：ddH2O漂洗1次，硝酸銀銀染10 min，ddH2O再漂洗1次，氫氧化鈉加甲醛顯色直到帶型清晰，ddH2O再次漂洗之后，拍照記錄帶型。

表2 28個(gè)SSR標(biāo)記的名稱(chēng)、引物序列及染色體位置Table 2 Name,sequence and chromosome location of 28 SSR markers

1.3.4 SSR標(biāo)記的數(shù)據(jù)記錄與統(tǒng)計(jì)分析

用多變量分析系統(tǒng)NTSYS-pc 2.10e統(tǒng)計(jì)軟件中的SM法計(jì)算遺傳相似系數(shù)，用SHAN Clustering和非加權(quán)組平均法(un-weighted pair group method with arithmetic mean,UPGMA)對(duì)供試品種進(jìn)行聚類(lèi)分析。用軟件SPSS 16.0中的LSD法進(jìn)行方差分析和多重比較。為進(jìn)一步確定不同來(lái)源組大麥品種最佳SSR標(biāo)記組合，以品種間存在兩個(gè)或兩個(gè)以上的差異位點(diǎn)數(shù)為品種鑒別篩選條件[26]，用MATLAB軟件[26]通過(guò)編程計(jì)算，確定鑒別區(qū)分3類(lèi)不同來(lái)源組大麥品種分別需要最少的標(biāo)記組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR分子標(biāo)記在參試品種間的多態(tài)性分析

由表3可以看出，28個(gè)SSR標(biāo)記在44個(gè)參試材料中共檢測(cè)到102個(gè)差異等位基因，各標(biāo)記的等位變異數(shù)介于2～6個(gè)，平均3.64個(gè)，其中，24個(gè)標(biāo)記在44個(gè)參試材料中的等位變異基因數(shù)在3個(gè)以上。SSR標(biāo)記的PIC值在0.08～0.77之間，平均為0.45。標(biāo)記Bmag0914的PIC值最高，為0.77；標(biāo)記EBmac0705的PIC值最低，為0.08。28個(gè)SSR標(biāo)記中，有4個(gè)標(biāo)記為低度多態(tài)性位點(diǎn)，占14.3%；有11個(gè)標(biāo)記為高多態(tài)性位點(diǎn)，占39.3%；有13個(gè)標(biāo)記為中度多態(tài)性位點(diǎn)，占46.4%，說(shuō)明選用的28個(gè)SSR標(biāo)記在參試品種間具有豐富的等位變異。28個(gè)SSR標(biāo)記在參試大麥品種間的H值在0.18～1.68之間，平均為0.92。其中標(biāo)記Bmag0914的H值最高，EBmac0705的H值最低，與PIC分析結(jié)果一致。進(jìn)一步說(shuō)明選用的SSR標(biāo)記在參試大麥品種間具有較高的多態(tài)性。圖1展示了標(biāo)記HVM36在不同來(lái)源組大麥品種間的多態(tài)性。

表3 28個(gè)標(biāo)記在參試品種間的多態(tài)性Table 3 Polymorphism of 28 markers among the tested varieties

2.2 基于SSR分子標(biāo)記的參試品種遺傳相似性分析

44個(gè)大麥品種間的遺傳相似系數(shù)的變化范圍在 0.529～0.961之間，均高于0.5，平均為 0.716，表明參試品種間遺傳親緣關(guān)系較為接近。由表4可知，江浙滬組、國(guó)內(nèi)組及國(guó)際組的遺傳相似系數(shù)均值分別為0.774 6、0.730 5和0.692 6，差異達(dá)極顯著水平。

表4 不同來(lái)源組大麥品種間的遺傳相似系數(shù)多重比較Table 4 Multiple comparisons of genetic similarity coefficients among different groups

2.3 鑒別篩選不同來(lái)源組大麥品種的SSR標(biāo)記組合

利用MATLAB軟件對(duì)28個(gè)SSR標(biāo)記的指紋數(shù)據(jù)在不同來(lái)源組大麥品種中進(jìn)行1 000次模擬試驗(yàn)，結(jié)果(圖2)可以看出，若不對(duì)標(biāo)記加以選擇(隨機(jī)使用這些標(biāo)記)，鑒別江浙滬組、國(guó)內(nèi)組和國(guó)際組大麥品種至少需要的標(biāo)記數(shù)分別為27、20和23個(gè)。

若從中精挑細(xì)選，可以獲得區(qū)分44個(gè)國(guó)內(nèi)外大麥品種所需要的最少標(biāo)記數(shù)，以品種間存在兩個(gè)或兩個(gè)以上的差異位點(diǎn)為篩選條件，江浙滬組、國(guó)內(nèi)組和國(guó)際組的最少標(biāo)記數(shù)分別為7、6和6個(gè)(表5中標(biāo)**的標(biāo)記)。考慮到分子標(biāo)記在大麥染色體上分布的均勻性及其對(duì)同一來(lái)源組其他大麥品種鑒別的廣適性，結(jié)合各分子標(biāo)記多態(tài)性及不同分子標(biāo)記組合的聚類(lèi)效果，初步認(rèn)為鑒別江浙滬組、國(guó)內(nèi)組及國(guó)際組的最佳SSR標(biāo)記數(shù)分別為14、15和15個(gè)(表5中標(biāo)**和*的標(biāo)記)。其中，江浙滬組14個(gè)最佳SSR標(biāo)記共檢測(cè)到57個(gè)等位基因，平均4.07個(gè)，其中標(biāo)記Bmac0316的H值最低，為0.46，標(biāo)記Bmag0914最高，為1.68；國(guó)內(nèi)組15個(gè)最佳SSR標(biāo)記共檢測(cè)到49個(gè)等位基因，平均3.77個(gè)，其中標(biāo)記Bmac0316的H值最低，為0.46，標(biāo)記scssr03907的H值最高，為1.61；國(guó)際組15個(gè)最佳SSR標(biāo)記共檢測(cè)到52個(gè)等位基因，平均4.33個(gè)，其中標(biāo)記Bmac 0316的H值最低，為0.46，標(biāo)記Bmag 0914H值最高，為1.68。

表5 鑒別不同來(lái)源組大麥品種的標(biāo)記數(shù)Table 5 Number of markers for identifying barley varieties from different groups

以鑒別不同來(lái)源組大麥品種所需的最佳SSR標(biāo)記對(duì)相應(yīng)來(lái)源組大麥品種進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果(圖3)可以看出，標(biāo)記在江浙滬組、國(guó)內(nèi)組和國(guó)際組大麥品種間的遺傳相似系數(shù)分別在0.47～0.86、0.35～0.77、0.25～0.83之間。當(dāng)遺傳相似系數(shù)分別為0.57、0.45、0.40時(shí)，江浙滬組、國(guó)內(nèi)組和國(guó)際組大麥品種分別可劃分為4、4和5大類(lèi)，來(lái)源地相同的品種大多被聚到相似的組內(nèi)。遺傳相似系數(shù)為0.86時(shí)，江浙滬組中浙秀12與花30被聚為一組；遺傳相似系數(shù)為0.77時(shí)，國(guó)內(nèi)組中川52209和駐7被聚為一組；遺傳相似系數(shù)為0.83時(shí)，國(guó)際組中Frankin與T98189被聚為一組。盡管遺傳相似系數(shù)很高，但結(jié)合各自分子標(biāo)記信息，浙秀12和花30、川52209和駐7、 Frankin與T98189分別存在2、3和3個(gè)位點(diǎn)差異，按照規(guī)程應(yīng)為不同的大麥品種[26]。說(shuō)明所選標(biāo)記及組合可以有效的鑒別不同來(lái)源組的大麥 品種。

3 討 論

目前，基于形態(tài)標(biāo)記的DUS測(cè)試仍然是鑒定品種真實(shí)性和純度的主要手段，也是植物品種侵權(quán)案件判定的重要技術(shù)手段，在品種授權(quán)、市場(chǎng)準(zhǔn)入和品種登記等方面起著不可替代的作用，是現(xiàn)代種植業(yè)健康發(fā)展的重要技術(shù)保障。與DUS形態(tài)鑒定法相比，SSR標(biāo)記鑒定法具有多態(tài)性高、操作簡(jiǎn)單、測(cè)試周期短等優(yōu)點(diǎn)，能從基因水平上比較全面反映不同品種間的遺傳差異，作為一種輔助手段已廣泛應(yīng)用于大麥新品種的鑒定中。但現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)品種的SSR指紋圖譜在實(shí)際應(yīng)用中仍然存在一定局限性，構(gòu)建市場(chǎng)上推廣品種及新審定品種的指紋圖譜，完善及更新現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)品種的指紋圖譜庫(kù)，才能更好地用于品種的鑒定[19]。本文選擇近20年不同地區(qū)育成的大麥品種為材料，既考慮到參試大麥品種的來(lái)源地和生態(tài)類(lèi)型，也考類(lèi)到品種的育成年代和推廣應(yīng)用情況，具有較好的代表性。

本研究利用分布在大麥7條染色體上的28個(gè)SSR分子標(biāo)記，在44個(gè)大麥品種中共檢測(cè)到102個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，每個(gè)標(biāo)記平均3.64個(gè)，各標(biāo)記位點(diǎn)的PIC值在0.08～0.77之間，平均為 0.45。28個(gè)標(biāo)記的Shannon’s多樣性指數(shù)在44個(gè)品種間的值在0.18～1.68之間，平均為0.92。Shannon’s多樣性指數(shù)是衡量種群多樣性的指數(shù)，Shannon’s多樣性指數(shù)越高，表明物種的多樣性就越高。根據(jù)28個(gè)SSR標(biāo)記的DNA指紋信息聚類(lèi)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)所選標(biāo)記完全可以有效鑒別區(qū)分開(kāi)3類(lèi)不同來(lái)源組內(nèi)的大麥品種。為篩選能鑒別不同來(lái)源組大麥品種的最少標(biāo)記數(shù)和最適的標(biāo)記組合，以及考慮到分子標(biāo)記在大麥染色體上分布的均勻性及其對(duì)同一來(lái)源組其他大麥品種鑒別的廣適性，并結(jié)合各分子標(biāo)記多態(tài)性及不同分子標(biāo)記組合的聚類(lèi)效果，本研究初步認(rèn)為，鑒別江浙滬組、國(guó)內(nèi)組和國(guó)際組大麥品種所需要的最佳標(biāo)記數(shù)分別為14、15和15個(gè)，說(shuō)明15個(gè)SSR標(biāo)記組合可有效地鑒別國(guó)內(nèi)外44個(gè)不同來(lái)源的大麥品種。但上述結(jié)果尚需到大麥種子生產(chǎn)和市場(chǎng)管理中加以應(yīng)用并驗(yàn)證。