不同氮素水平下大麥谷氨酰胺合成酶基因(HvGS1)表達(dá)及其與籽粒氮素積累的關(guān)系

徐壽軍，劉志萍， 郭呈宇，呂二鎖，董永義，張繼星，薛海楠，王 磊，李國興，德木其格

(1.內(nèi)蒙古民族大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古通遼 028043；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)研究院作物所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031)

氮素是限制作物產(chǎn)量的主要營養(yǎng)元素之一，無論是直接來源于硝酸鹽、胺離子、微生物固定的氮，還是植物代謝過程中釋放的氨，都必須經(jīng)過谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS) 催化才能同化為氨基酸[1]，進(jìn)而合成蛋白質(zhì)。GS是作物籽粒蛋白質(zhì)合成的關(guān)鍵酶[2-3]，分布在作物的根、莖稈、葉片、果實(shí)、種子等器官中，直接影響作物對氮素的吸收和利用。其在作物體中通常有兩種存在形態(tài)：一是細(xì)胞質(zhì)型，存在于細(xì)胞質(zhì)中，稱為GS1；二是葉綠體型，存在于葉綠體中，稱為GS2。GS1一直是植物生理學(xué)和營養(yǎng)學(xué)方面的研究熱點(diǎn)，主要參與種子萌發(fā)時儲存氮素的轉(zhuǎn)運(yùn)和葉片衰老時氮源的轉(zhuǎn)移與再利用[4-5]。

灌漿期是大麥等作物籽粒產(chǎn)量和蛋白質(zhì)形成的關(guān)鍵時期，其籽粒中的氮素來源包括營養(yǎng)器官轉(zhuǎn)移的氮素和植株從土壤中吸收的氮素。Tabuchi等[12]研究表明，HvGS1對于水稻籽粒灌漿起非常關(guān)鍵的作用，HvGS1缺失后水稻植株的灌漿速率和灌漿程度都嚴(yán)重降低。就麥類作物而言，籽粒中的氮素積累主要來自生育后期營養(yǎng)體中氮素的重新分配[13]。小麥籽粒中約70%的氮來自花前氮素同化[14-15]，大麥生育后期根部吸收的氮素并不多，作物花前莖稈、葉片等營養(yǎng)器官積累氮素向籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)是籽粒氮素的重要來源[16-17]。大麥葉片中HvGS1表達(dá)的變化與營養(yǎng)器官儲存氮素的轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)系密切，在籽粒灌漿期間，營養(yǎng)器官HvGS1的表達(dá)動態(tài)如何，如何影響籽粒氮素積累，目前此方面的研究尚未見報(bào)道。本研究以大麥品種蒙啤1號、蒙啤3號、甘啤4號和墾啤7號為試材，研究了不同氮肥用量下大麥灌漿期間葉片HvGS1表達(dá)及其與籽粒氮素積累的關(guān)系，以期為優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)大麥栽培生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

本試驗(yàn)于2016和2017年在內(nèi)蒙古通遼市科爾沁區(qū)農(nóng)牧業(yè)高新科技示范園區(qū)試驗(yàn)農(nóng)場進(jìn)行(43°63′N,122°25′E)。試驗(yàn)地土壤肥力均勻，耕層土壤有機(jī)質(zhì)含量為17.52 g·kg-1，堿解氮含量為45.20 mg·kg-1，速效磷含量為28.32 mg·kg-1，速效鉀含量為128.52 mg·kg-1，pH為8.1。該地年平均氣溫6.1 ℃，≥10 ℃活動積溫3 160 ℃，日照時數(shù)3 113 h，年平均降水量 350 mm。

1.2 試驗(yàn)材料及設(shè)計(jì)

供試大麥品種為蒙啤1號、蒙啤3號、甘啤4號和墾啤7號，均由內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院提供。試驗(yàn)設(shè)0、90、180和270 kg·hm-24個氮肥水平，分別記為CK、NL、NM和NH。氮肥分2次施入，70%氮肥在播種時施入，其余氮肥在拔節(jié)時追施。每個處理均基施P2O5120 kg·hm-2和K2O 75 kg·hm-2。小區(qū)面積20 m2，每小區(qū)16行，行長5 m，行距0.25 m。每行播種500粒，人工點(diǎn)播，3葉期間苗，株距2 cm。隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，2016年3月26日播種，2017年3月25日播種，栽培管理同大田。

1.3 樣品的采集、測定

各小區(qū)選擇長勢相近、同一天開花的大麥植株標(biāo)記。于花后7、14、21和28 d及成熟期分別取所標(biāo)記大麥20株，按葉片、莖稈、籽粒等不同部位分開，10株放于液氮中快速冷凍，然后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱內(nèi)保存，用于測定HvGS1相對表達(dá)量。另外10株在105 ℃下殺青0.5 h，80 ℃下烘干至恒重，用小型粉碎機(jī)粉碎后凱氏定氮法測定氮含量[18]。

HvGS1相對表達(dá)量采用熒光定量PCR 技術(shù)測定?？俁NA提取后逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再熒光定量PCR擴(kuò)增。參照Gene Bank 數(shù)據(jù)庫中各目的基因的序列，根據(jù)ABI公司的Primer Express Software v2.0設(shè)計(jì)引物(表1)。反應(yīng)體系(16 μL)包括H2O 5 μL、2×SYBGEEN PCR mix 8 μL、上下游引物(10 pmol μL-1) 各1 μL、模板cDNA 1 μL。反應(yīng)程序:95 ℃預(yù)變性2 min； 95 ℃ 10 s,72 ℃ 40 s,50個循環(huán)。結(jié)果采用2-⊿⊿Ct算法來計(jì)算[19]。

表1 本研究所用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Office Excel 2007軟件和SPSS(19.0)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮肥處理下大麥灌漿期間葉片氮含量的變化

由表2可知，隨著灌漿進(jìn)程，4個品種葉片氮含量均呈逐漸降低的趨勢。隨著施氮水平的增加，各時期各處理葉片氮含量逐漸增加。2年的變化趨勢基本一致。

2016年，在花后7 d時，蒙啤1號和蒙啤3號NL處理的葉片氮含量與CK差異均顯著，NM與NH處理間差異均不顯著。甘啤4號和墾啤7號的4個處理間差異均顯著。在花后14 d時，蒙啤3號NL處理的氮含量與CK差異不顯著，其他處理與CK差異均顯著；其他品種在NM和NH處理間差異均顯著。在花后21 d時，4個品種NL處理的氮含量與CK差異均不顯著， NM和NH處理與CK間差異均達(dá)到顯著水平，NL、NM處理間差異均不顯著，二者與NH處理間差異均顯著，NM與NH處理間差異均不顯著。在花后 28 d時，蒙啤1號和蒙啤3號NL處理的氮含量與CK差異均不顯著， NM和NH處理與CK差異均達(dá)到顯著水平。NL與NM、NM與NH處理間差異均不顯著。甘啤4號和墾啤7號NL和NM處理與CK差異均不顯著， NH處理與CK差異均達(dá)到顯著水平。

2017年，在花后7 d時，4個品種的NL處理葉片氮含量與CK差異大部分顯著，NM與NH處理間差異均不顯著。在花后14 d時，蒙啤1號、甘啤4號NL處理的氮含量與CK差異均不顯著，其他處理與CK差異均顯著；蒙啤3號、墾啤7號施氮處理與CK間差異均達(dá)到顯著水平。在花后21 d時，除蒙啤3號外，其他3個品種NL處理的氮含量與CK差異均不顯著， NM和NH處理與CK差異均顯著。在花后28 d時，蒙啤1號和墾啤7號NL處理的氮含量與CK 差異均不顯著，NM和NH處理與CK差異均顯著。NL與NM、NM與NH處理間差異均不顯著。蒙啤3號和甘啤4號的NL處理與CK 差異均不顯著，NH和NM處理與CK差異均顯著。

2.2 不同氮肥處理下大麥灌漿期間葉片 HvGS1相對表達(dá)量的變化

由圖1和圖2可知，隨著灌漿進(jìn)程，大麥葉片HvGS1相對表達(dá)量均呈逐漸升高的趨勢，一直到花后28 d仍維持較高的表達(dá)水平；各時期各處理隨著施氮水平的增加，HvGS1相對表達(dá)量均上調(diào)，說明增施氮肥可提高葉片HvGS1相對表達(dá)量。

表2 不同氮肥處理大麥葉片氮含量變化Table 2 Changes of nitrogen content in barley leaves under different nitrogen levels %

2016年，在花后7 d時，蒙啤1號葉片HvGS1相對表達(dá)量在不同處理間差異均顯著，其他3個品種NL與CK、NM與NH處理間差異均不顯著，NL與NM處理間差異均顯著。在花后14 d時，除甘啤4號外，其他品種的施氮處理與CK間差異均達(dá)顯著水平，NM與NH處理間差異均不顯著。在花后21 d時，蒙啤1號和甘啤4號NL處理與CK間差異均不顯著， NM和NH處理與CK差異均顯著，NM與NH處理間差異均顯著。蒙啤3號和墾啤7號的CK、NL、NM處理間差異均不顯著，三者與NH處理差異均顯著。在花后28 d時，蒙啤1號的NM與NH處理間差異不顯著；甘啤4號的NL處理與CK、NM處理間差異均不顯著，NM與NH處理間差異不顯著；蒙啤3號、墾啤7號的NM與NH處理間差異均不顯著，但二者與其他處理間差異基本均達(dá)到顯著水平。

2017年，在花后7 d時，蒙啤1號和蒙啤3號的葉片HvGS1相對表達(dá)量在NL處理與CK間、 NL與NH處理間差異均顯著。在花后14 d時，除蒙啤1號外，其他品種施氮處理與CK間差異均顯著。在花后21 d時，蒙啤1號和蒙啤3號NL處理與CK間差異均不顯著，NM和NH處理間差異均顯著，NM與NL處理間差異均不顯著。甘啤4號和墾啤7號NL處理與CK間差異均不顯著。在花后28 d時，蒙啤1號的NL與NM處理差異不顯著，墾啤7號的NL處理與CK差異不顯著，其他品種的不同處理間差異均顯著。

2.3 不同灌漿時期葉片 HvGS1相對表達(dá)量與供氮水平及葉片氮含量的相關(guān)性

相關(guān)分析(表3)表明，大麥各灌漿時期葉片HvGS1相對表達(dá)量與供氮水平及葉片氮含量均呈極顯著正相關(guān)，說明在本試驗(yàn)設(shè)定范圍內(nèi)，增加施氮量會促進(jìn)大麥葉片氮素積累，并引起HvGS1呈上調(diào)表達(dá)。不同灌漿時期葉片HvGS1的相對表達(dá)量與成熟期籽粒氮含量均呈顯著或極顯著正相關(guān)，其中花后28 d的相關(guān)性最大，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.514 7，表明大麥葉片中HvGS1的上調(diào)表達(dá)有助于提高成熟籽粒的氮素含量，有利于改善最終品質(zhì)。

進(jìn)一步的通徑分析(圖3)表明，對成熟期籽粒氮含量影響最大的也是花后28 dHvGS1表達(dá)水平，直接通徑系數(shù)為0.490 6；其次是花后7 dHvGS1表達(dá)水平，直接通徑系數(shù)為0.211 3。從相關(guān)性結(jié)果看，4個時期HvGS1相對表達(dá)量與成熟期籽粒氮含量均呈正相關(guān)，但通徑分析結(jié)果卻顯示，花后21 d的HvGS1表達(dá)水平與成熟期籽粒氮含量呈負(fù)相關(guān)，這是因?yàn)榛ê?21 d與花后 7 d、14 d和28 d的HvGS1表達(dá)水平間均存在極顯著的相關(guān)關(guān)系，從而掩蓋了其實(shí)質(zhì)效應(yīng)。

表3 葉片 HvGS1相對表達(dá)量與供氮水平及氮含量的相關(guān)系數(shù)Table 3 Coefficients of correlation between relative expression of HvGS1 and nitrogen supply level and nitrogen content in leaves

3 討 論

高等植物中HvGS1表達(dá)是一個復(fù)雜過程，在不同條件下、不同植物或種屬間表達(dá)量均存在差異。眾多學(xué)者對作物不同生育時期HvGS1的表達(dá)動態(tài)進(jìn)行了研究，烤煙葉片HvGS1表達(dá)豐度在葉齡 35 d 時非常低，葉齡 45 d 時HvGS1表達(dá)豐度大幅上調(diào)，在葉齡 55 d 時達(dá)到最大值，隨后該基因逐漸下調(diào)表達(dá)[20]。徐振華等[21]研究認(rèn)為，在水稻灌漿過程中籽粒HvGS1.3的表達(dá)量呈單峰曲線變化，峰值出現(xiàn)在抽穗后15～20d。金正勛等[22]研究也認(rèn)為，水稻葉片和籽粒中HvGS1的表達(dá)量在灌漿進(jìn)程中呈單峰曲線變化，先逐漸升高，達(dá)到峰值后快速下降，峰值出現(xiàn)在灌漿中期(花后20 d)。在低氮條件下，小麥地上部HvGS1的表達(dá)在抽穗期以后顯著增強(qiáng)。在高氮條件下，HvGS1表達(dá)水平從分蘗期到抽穗期有降低的趨勢，而從抽穗期到灌漿期又有升高的趨勢[23]。本研究結(jié)果顯示，大麥灌漿過程中，隨著灌漿進(jìn)程，HvGS1相對表達(dá)量呈逐漸升高的趨勢，一直到花后28 d葉片即將衰老時仍維持較高的表達(dá)水平。與本研究結(jié)果一致，王小純等[1]也發(fā)現(xiàn)，小麥葉片HvGS1的表達(dá)量在開始衰老時 最大。

HvGS1表達(dá)受氮肥供應(yīng)水平影響，不同條件下，不同作物的表達(dá)變化不盡相同，有些甚至相反。在低氮條件下，隨著氮素濃度的增加，HvGS1在黃瓜中的表達(dá)量逐漸升高，但在高氮條件下，其表達(dá)并沒有因?yàn)樨S富的氮源而保持較高的表達(dá)量，反而受到了抑制，說明并不是氮濃度越高，HvGS1表達(dá)量越大，較高的氮素濃度反而對黃瓜的氮代謝有負(fù)面影響[10]。 徐心志[24]認(rèn)為，低氮能促進(jìn)小麥旗葉中HvGS1的轉(zhuǎn)錄，而高氮則能降低其轉(zhuǎn)錄水平。而有研究表明，增加水稻灌漿成熟期氮素營養(yǎng)不僅會延長HvGS1高表達(dá)持續(xù)時間，而且可提高其轉(zhuǎn)錄表達(dá)量[9]。大麥方面，陳志偉等研究表明，大麥在低氮脅迫下，無論是低氮敏感基因型品種，還是耐低氮基因型品種，其HvGS1總體上來說都呈現(xiàn)上調(diào)表達(dá)[25]。本研究結(jié)果表明，大麥灌漿期間，葉片HvGS1相對表達(dá)量隨著供氮水平的增加呈上調(diào)表達(dá)，二者具有顯著的正相關(guān)關(guān)系。徐紅衛(wèi)等[26]研究亦表明，大麥葉片HvGS1-1的相對表達(dá)水平與不同氮素處理具有顯著正相關(guān)性，這與本研究結(jié)果一致。

HvGS1相對表達(dá)量與氮含量和蛋白質(zhì)含量等密切相關(guān)。Cai等[27]研究表明，轉(zhuǎn)基因(HvGS1)水稻整株總氮提高，這與轉(zhuǎn)基因水稻中HvGS1表達(dá)量的增加有關(guān)。超量表達(dá)HvGS1能夠顯著提高作物的鮮重、干重、蛋白質(zhì)含量[28-30]。Habash 等[31]也發(fā)現(xiàn)，在小麥根中過表達(dá)HvGS1能夠增加氮的積累能力，表明HvGS1表達(dá)量與氮含量呈正相關(guān)。有研究認(rèn)為，水稻籽粒蛋白質(zhì)含量與HvGS1.3基因的表達(dá)量是同步變化關(guān)系，表明蛋白質(zhì)含量與籽粒HvGS1的表達(dá)量有很密切的關(guān)系[21]。袁曉磊等[23]研究認(rèn)為，HvGS表達(dá)量的增加有利于小麥提高地上部分氮含量、生物量和產(chǎn)量。不同葉片的含氮量不同，其HvGS1的表達(dá)也存在差異。有研究發(fā)現(xiàn)，茶樹葉片氮含量與HvGS1表達(dá)呈負(fù)線性相關(guān)[32]，烤煙葉片HvGS1表達(dá)豐度與葉片總氮、葉片銨濃度、質(zhì)外體銨濃度以及氨氣揮發(fā)量呈極顯著負(fù)相關(guān)[20]。本研究結(jié)果顯示，隨著大麥葉片氮含量的增加，HvGS1相對表達(dá)量升高，二者間呈顯著正相關(guān)；各灌漿時期葉片HvGS1相對表達(dá)量與成熟期籽粒氮含量亦呈顯著正相關(guān)，說明HvGS1表達(dá)增強(qiáng)有利于灌漿期間營養(yǎng)器官的氮素轉(zhuǎn)運(yùn)和籽粒氮素的積累。相關(guān)和通徑分析結(jié)果也表明，在灌漿各時期中，影響大麥成熟期籽粒氮含量最大的是花后28 d的葉片HvGS1相對表達(dá)量，其相關(guān)系數(shù)和直接通徑系數(shù)分別為0.610 9和0.490 6?；ê?8 d是大麥蠟熟期，是葉片即將衰老的時間[33]，也是HvGS1在葉片中表達(dá)的高峰期，此時儲存在葉片的氮開始向籽粒轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)一步證明在麥類作物中，HvGS1與氮素的轉(zhuǎn)移再利用有關(guān)，說明保持灌漿后期營養(yǎng)器官HvGS1高表達(dá)量，有利于氮素從源轉(zhuǎn)運(yùn)到庫，促進(jìn)籽粒氮素積累。提示在生產(chǎn)實(shí)踐中，花后28 d可以作為判斷大麥葉片氮素向籽粒轉(zhuǎn)移的臨界時間點(diǎn)，維持此期葉片HvGS1高表達(dá)量，可以保障氮源充足，有利于提高產(chǎn)量和品質(zhì)。

4 結(jié) 論

大麥葉片中HvGS1相對表達(dá)量隨著施氮水平增加呈上調(diào)表達(dá)，隨灌漿進(jìn)程逐漸升高；HvGS1表達(dá)與供氮水平、氮含量均呈極顯著正相關(guān)，與籽粒氮素積累關(guān)系密切。