自制實時定量PCR試劑在基因擴增中的效果評價

＊姬麗娟 李倩 李漢超 郝志明

（西安交通大學 陜西 710000）

引言

實時定量PCR（Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，qPCR），PCR聚合酶聯(lián)反應是體外選擇性擴增特定基因片段技術，被廣泛應用臨床基因診斷、食品安全、環(huán)境污染檢測，該項技術能夠準確的獲取基因片段，且特異性、靈敏度高，是目前檢測核酸拷貝數(shù)的可靠方法之一。

1.Taq DNA聚合酶的制備

(1)Taq-DNA聚合酶的表達

取pTaq質(zhì)粒lμL與感受態(tài)大腸桿菌E coli DH5a菌株進行混合，冰浴30min，42℃水浴90s，然后冰浴5min，進行質(zhì)粒的熱休克。加入500μL不含氨芐青霉索（Amp）的LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)2h。取100μL培養(yǎng)液均勻涂布在含有100μg/mL氨芐青霉（Amp）的LB固體培養(yǎng)基，置于37℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24h，挑選陽性重組克隆。轉接于Amp濃度為100μg/mL的5mL LB液體培養(yǎng)基，37℃、180r／min培養(yǎng)2h（OD600=0.4）后，加入100μL IPTG（1mol/L），37℃180r/min振蕩培養(yǎng)6h，誘導Taq-DNA聚合酶基因的表達。

(2)Taq DNA聚合酶的提取和純化

3500rpm離心10分鐘收集菌體，按10:1體積加入重懸液（100mmol/L Tris-HCl（pH8.0），0.1mmol/L EDTA，0.1mmol/L DTT，10%甘油）重懸沉淀，具體純化過程參考文獻劉欽松重組Taq DNA聚合酶的表達和純化鑒定。

(3)重組Taq DNA聚合酶的活性測定

PCR反應體系總體積為20μL，反應組成為：商品化的10×PCR buffer 2μL，引物F（20μM）0.2μL，引物R（20μM）0.2μL，模板pAAV-LacZ 0.5μL，MgCl2（20mmol/L）2μL，d NTP（2.5mmol/L）2μL，Taq DNA聚合酶（0.1μL，0.5μL，1μL，2μL），滅菌ddH2O補足20μL。即用不同濃度純化的Taq DNA聚合酶進行PCR擴增實驗，以市售商品化的Taq DNA聚合酶（天根）1U為對照。通過比較擴增產(chǎn)物電泳條帶的亮度估算純化的酶活性及用量，用于后續(xù)實驗的PCR擴增。

根據(jù)引物CMV（正向引物F：5'-GCGTGGATAGCGGTTTGACT-3'反向引物R：5'-CAATGGGGCGGAGTTGTT-3'）確定擴增反應程序為：95℃預變性5min，95℃變性15s，55℃退火30s，30個循環(huán)。循環(huán)結束后72℃延伸10min，4℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳儀進行檢測產(chǎn)物質(zhì)量。

2.實時定量PCR mix的配置及條件優(yōu)化

(1)配置實時定量PCR mix

參照EvaGreen染料說明書以及文獻配方，自制的10×PCR buffer配置方法如下：100mM Tris-HCl，pH8.5，500mM KCl，20mM MgCl2，1.5% Triton X-100。

在總體積為20μL的PCR反應體系中，反應組成如下：自制的10×PCR buffer 2μL，引物F（20μM）0.2μL，引物R（20μM）0.2μL，pAAV-LacZ 0.5μL，Taq DNA聚合酶0.1μL（根據(jù)1.3實驗結果所得），EvaGreen1μL，滅菌ddH2O補足20μL。以商品化10×real-time PCR mix做對照，反應體積及反應組成同上。引物及擴增反應程序同1.3。循環(huán)結束后4℃保存。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

(2)自制實時定量PCR試劑的優(yōu)化

在現(xiàn)有的反應體系中，我們嘗試分別加入二甲基亞砜（DMSO）、甘油、甲酰胺、海藻糖、牛血清白蛋白（BSA）等對PCR反應體系有增強作用的試劑，觀察對real-time PCR結果有無影響。具體用量：DMSO 5%；甘油10%；甲酰胺5%；海藻糖0.1mol/L；BSA：50mg/L；余條件同2.1。并將起始濃度為1.2×1012copies/mL的AAV-LacZ質(zhì)粒模版進行10倍稀釋，連續(xù)7個梯度，觀察自制試劑與商品化試劑的差異。

3.自制實時定量PCR mix的穩(wěn)定性驗證

將配置的自制實時定量PCR mix 1mL在-80℃下反復凍融，每次凍融后取樣100μL于4℃保存，用于后續(xù)PCR擴增。待凍融7次之后，以pAAV-LacZ為模版進行PCR擴增反應，收集熒光信號，觀察Ct值變化。

(1)數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采集，PCR反應效率，標準曲線擬合等均應用（數(shù)據(jù)分析軟件PCR分析儀電泳儀）。

(2)實驗結果

原核表達純化的Taq DNA聚合酶純度較高，與商品化的Taq DNA聚合酶活性接近。

4.自制real-time PCR mix的條件優(yōu)化

（1）自制的PCR mix與市售的mix對比，結果顯示：自制的實時定量PCR試劑與商品化試劑擴增曲線接近，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示qPCR擴增條帶單一清晰。

（2）PCR反應增強劑對qPCR影響。在現(xiàn)有的PCR mix中分別加入DMSO、甘油、甲酰胺、海藻糖、BSA等文獻中報道對PCR反應體系有增強作用試劑，加入甘油和BSA的PCR反應體系qPCR的Ct值與不加反應增強劑的接近，加DMSO，海藻糖的PCR體系Ct值均大于不加任何增強劑的Ct值，而加入甲酰胺后無Ct值。因此，下一步優(yōu)化甘油和BSA的使用濃度。

甘油5%、10%，BSA 50mg/L、100mg/L兩個梯度，兩種單獨或者組合搭配，行qPCR觀察擴增效率。可見使用5%甘油+100mg/L BSA時，qPCR的Ct值最小。因此，最終選擇5%丙三醇+100mg/L BSA。

（3）優(yōu)化后qPCR mix與市售商品化qPCR mix的擴增效率比較。優(yōu)化后real-time PCR mix組成：100mM Tris-HCl，pH8.5，500mM KCl，20mM MgCl2，1.5%Triton X-100，dNTP，Taq DNA聚合酶，EvaGreen，5%丙三醇+100mg/L BSA。

在相同反應參數(shù)、反應體系下，倍比稀釋模板（1012，1011，1010，109，108，107，106，105），觀察自制qPCR擴增曲線及Ct值與市售羅氏和Gene Star qPCR mix差異。自制qPCR的擴增曲線良好，Ct值隨模版濃度的降低逐漸增大，與羅氏和Gene Star qPCR mix無明顯差異。

（4）自制10×qPCR mix的穩(wěn)定性檢測。將自制10×qPCR mix反復凍融后行qPCR，經(jīng)反復凍融后，qPCR擴增曲線及Ct值均無明顯變化。

5.結論與討論

據(jù)目前所了解市售商品化real-time PCR mix大多采用SYBR Green I作為其熒光染料，SYBR Green I是利用插入雙鏈DNA小溝中發(fā)光的特性監(jiān)測擴增產(chǎn)物增加，使用簡便易行、成本較低，但特異性相對較差，同時對PCR反應有一定的抑制作用，染料濃度以及染料與反應體系組成需要繁瑣嚴格的優(yōu)化。而EvaGreen是常用于高分辨率溶解曲線分析的飽和DNA雙鏈熒光染料，熒光信號強，不抑制PCR反應。因此，本實驗直接采用EvaGreen作為熒光染料進行后續(xù)實驗。

各種PCR反應增強劑作用機理不同，DMSO主要用于高GC含量的模板擴增，可能的機理是改善CG含量高的DNA變形情況，降低其二級結構，使得聚合酶在二級結構處延伸，一般超過體積的10%會影響其保真性；甘油：保護Taq酶，增加酶的穩(wěn)定性，以提高產(chǎn)量；甲酰胺：促進引物-模板退火，降低帶有二級結構的DNA的變性溫度；海藻糖亦主要用于高GC含量模板的擴增；BSA是某些酶的穩(wěn)定劑，還能防止酶蛋白在玻璃器皿表面的附著。而在本實驗中，甲酰胺，海藻糖，DMSO均不同程度的影響了qPCR的反應效率，可能與其用量及試劑本身的純度有關，需要進一步的實驗驗證。

本實驗中，原核表達純化Taq DNA聚合酶具有較高的純度，0.1μL的自制酶活性與1U市售Taq DNA聚合酶相當。以此酶自制10×qPCR mix：100mM Tris-HCl，pH8.5，500mM KCl，20mM MgCl2，1.5% Triton X-100，dNTP，Taq DNA聚合酶，EvaGreen，5%丙三醇+100mg/L BSA。該試劑擴增效率與市售商品化qPCR mix無差異，易保存，穩(wěn)定性良好且價格便宜，可廣泛應用于核酸定量檢測。