*姬麗娟 李倩 李漢超 郝志明
(西安交通大學 陜西 710000)
實時定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,qPCR),PCR聚合酶聯(lián)反應是體外選擇性擴增特定基因片段技術,被廣泛應用臨床基因診斷、食品安全、環(huán)境污染檢測,該項技術能夠準確的獲取基因片段,且特異性、靈敏度高,是目前檢測核酸拷貝數(shù)的可靠方法之一。
(1)Taq-DNA聚合酶的表達
取pTaq質(zhì)粒lμL與感受態(tài)大腸桿菌E coli DH5a菌株進行混合,冰浴30min,42℃水浴90s,然后冰浴5min,進行質(zhì)粒的熱休克。加入500μL不含氨芐青霉索(Amp)的LB液體培養(yǎng)基,37℃振蕩培養(yǎng)2h。取100μL培養(yǎng)液均勻涂布在含有100μg/mL氨芐青霉(Amp)的LB固體培養(yǎng)基,置于37℃培養(yǎng)箱中,培養(yǎng)24h,挑選陽性重組克隆。轉接于Amp濃度為100μg/mL的5mL LB液體培養(yǎng)基,37℃、180r/min培養(yǎng)2h(OD600=0.4)后,加入100μL IPTG(1mol/L),37℃180r/min振蕩培養(yǎng)6h,誘導Taq-DNA聚合酶基因的表達。
(2)Taq DNA聚合酶的提取和純化
3500rpm離心10分鐘收集菌體,按10:1體積加入重懸液(100mmol/L Tris-HCl(pH8.0),0.1mmol/L EDTA,0.1mmol/L DTT,10%甘油)重懸沉淀,具體純化過程參考文獻劉欽松重組Taq DNA聚合酶的表達和純化鑒定。
(3)重組Taq DNA聚合酶的活性測定
PCR反應體系總體積為20μL,反應組成為:商品化的10×PCR buffer 2μL,引物F(20μM)0.2μL,引物R(20μM)0.2μL,模板pAAV-LacZ 0.5μL,MgCl2(20mmol/L)2μL,d NTP(2.5mmol/L)2μL,Taq DNA聚合酶(0.1μL,0.5μL,1μL,2μL),滅菌ddH2O補足20μL。即用不同濃度純化的Taq DNA聚合酶進行PCR擴增實驗,以市售商品化的Taq DNA聚合酶(天根)1U為對照。通過比較擴增產(chǎn)物電泳條帶的亮度估算純化的酶活性及用量,用于后續(xù)實驗的PCR擴增。
根據(jù)引物CMV(正向引物F:5'-GCGTGGATAGCGGTTTGACT-3'反向引物R:5'-CAATGGGGCGGAGTTGTT-3')確定擴增反應程序為:95℃預變性5min,95℃變性15s,55℃退火30s,30個循環(huán)。循環(huán)結束后72℃延伸10min,4℃保存。2%瓊脂糖凝膠電泳儀進行檢測產(chǎn)物質(zhì)量。
(1)配置實時定量PCR mix
參照EvaGreen染料說明書以及文獻配方,自制的10×PCR buffer配置方法如下:100mM Tris-HCl,pH8.5,500mM KCl,20mM MgCl2,1.5% Triton X-100。
在總體積為20μL的PCR反應體系中,反應組成如下:自制的10×PCR buffer 2μL,引物F(20μM)0.2μL,引物R(20μM)0.2μL,pAAV-LacZ 0.5μL,Taq DNA聚合酶0.1μL(根據(jù)1.3實驗結果所得),EvaGreen1μL,滅菌ddH2O補足20μL。以商品化10×real-time PCR mix做對照,反應體積及反應組成同上。引物及擴增反應程序同1.3。循環(huán)結束后4℃保存。PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
(2)自制實時定量PCR試劑的優(yōu)化
在現(xiàn)有的反應體系中,我們嘗試分別加入二甲基亞砜(DMSO)、甘油、甲酰胺、海藻糖、牛血清白蛋白(BSA)等對PCR反應體系有增強作用的試劑,觀察對real-time PCR結果有無影響。具體用量:DMSO 5%;甘油10%;甲酰胺5%;海藻糖0.1mol/L;BSA:50mg/L;余條件同2.1。并將起始濃度為1.2×1012copies/mL的AAV-LacZ質(zhì)粒模版進行10倍稀釋,連續(xù)7個梯度,觀察自制試劑與商品化試劑的差異。
將配置的自制實時定量PCR mix 1mL在-80℃下反復凍融,每次凍融后取樣100μL于4℃保存,用于后續(xù)PCR擴增。待凍融7次之后,以pAAV-LacZ為模版進行PCR擴增反應,收集熒光信號,觀察Ct值變化。
(1)數(shù)據(jù)分析
數(shù)據(jù)采集,PCR反應效率,標準曲線擬合等均應用(數(shù)據(jù)分析軟件PCR分析儀電泳儀)。
(2)實驗結果
原核表達純化的Taq DNA聚合酶純度較高,與商品化的Taq DNA聚合酶活性接近。
(1)自制的PCR mix與市售的mix對比,結果顯示:自制的實時定量PCR試劑與商品化試劑擴增曲線接近,瓊脂糖凝膠電泳結果顯示qPCR擴增條帶單一清晰。
(2)PCR反應增強劑對qPCR影響。在現(xiàn)有的PCR mix中分別加入DMSO、甘油、甲酰胺、海藻糖、BSA等文獻中報道對PCR反應體系有增強作用試劑,加入甘油和BSA的PCR反應體系qPCR的Ct值與不加反應增強劑的接近,加DMSO,海藻糖的PCR體系Ct值均大于不加任何增強劑的Ct值,而加入甲酰胺后無Ct值。因此,下一步優(yōu)化甘油和BSA的使用濃度。
甘油5%、10%,BSA 50mg/L、100mg/L兩個梯度,兩種單獨或者組合搭配,行qPCR觀察擴增效率。可見使用5%甘油+100mg/L BSA時,qPCR的Ct值最小。因此,最終選擇5%丙三醇+100mg/L BSA。
(3)優(yōu)化后qPCR mix與市售商品化qPCR mix的擴增效率比較。優(yōu)化后real-time PCR mix組成:100mM Tris-HCl,pH8.5,500mM KCl,20mM MgCl2,1.5%Triton X-100,dNTP,Taq DNA聚合酶,EvaGreen,5%丙三醇+100mg/L BSA。
在相同反應參數(shù)、反應體系下,倍比稀釋模板(1012,1011,1010,109,108,107,106,105),觀察自制qPCR擴增曲線及Ct值與市售羅氏和Gene Star qPCR mix差異。自制qPCR的擴增曲線良好,Ct值隨模版濃度的降低逐漸增大,與羅氏和Gene Star qPCR mix無明顯差異。
(4)自制10×qPCR mix的穩(wěn)定性檢測。將自制10×qPCR mix反復凍融后行qPCR,經(jīng)反復凍融后,qPCR擴增曲線及Ct值均無明顯變化。
據(jù)目前所了解市售商品化real-time PCR mix大多采用SYBR Green I作為其熒光染料,SYBR Green I是利用插入雙鏈DNA小溝中發(fā)光的特性監(jiān)測擴增產(chǎn)物增加,使用簡便易行、成本較低,但特異性相對較差,同時對PCR反應有一定的抑制作用,染料濃度以及染料與反應體系組成需要繁瑣嚴格的優(yōu)化。而EvaGreen是常用于高分辨率溶解曲線分析的飽和DNA雙鏈熒光染料,熒光信號強,不抑制PCR反應。因此,本實驗直接采用EvaGreen作為熒光染料進行后續(xù)實驗。
各種PCR反應增強劑作用機理不同,DMSO主要用于高GC含量的模板擴增,可能的機理是改善CG含量高的DNA變形情況,降低其二級結構,使得聚合酶在二級結構處延伸,一般超過體積的10%會影響其保真性;甘油:保護Taq酶,增加酶的穩(wěn)定性,以提高產(chǎn)量;甲酰胺:促進引物-模板退火,降低帶有二級結構的DNA的變性溫度;海藻糖亦主要用于高GC含量模板的擴增;BSA是某些酶的穩(wěn)定劑,還能防止酶蛋白在玻璃器皿表面的附著。而在本實驗中,甲酰胺,海藻糖,DMSO均不同程度的影響了qPCR的反應效率,可能與其用量及試劑本身的純度有關,需要進一步的實驗驗證。
本實驗中,原核表達純化Taq DNA聚合酶具有較高的純度,0.1μL的自制酶活性與1U市售Taq DNA聚合酶相當。以此酶自制10×qPCR mix:100mM Tris-HCl,pH8.5,500mM KCl,20mM MgCl2,1.5% Triton X-100,dNTP,Taq DNA聚合酶,EvaGreen,5%丙三醇+100mg/L BSA。該試劑擴增效率與市售商品化qPCR mix無差異,易保存,穩(wěn)定性良好且價格便宜,可廣泛應用于核酸定量檢測。