金銀花和山銀花指紋圖譜及譜效關(guān)系的研究進(jìn)展

晏薇娜 王美會 唐文文 鄧 偉 李繡菊

(銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州 銅仁 554300)

金銀花為忍冬科植物忍冬【Lonicera japonica Thunb.】的干燥花蕾，山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬【Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.】、紅腺忍冬【Lonicera hypoglauca Miq.】、華南忍冬【Lonicera confusa DC.】或黃褐毛忍冬【Lonicera fulvotomentosa Hsu et S.C.Cheng】的干燥花蕾，二者皆有清熱解毒，疏風(fēng)散熱的功效，成為人們的常用中藥。隨著鄉(xiāng)村振興政策發(fā)展，金銀花和山銀花的種植、開發(fā)、銷售逐漸被打造升級，發(fā)展成為完善的產(chǎn)業(yè)鏈助推區(qū)域經(jīng)濟(jì)發(fā)展[1][2]，但金銀花和山銀花本身化學(xué)組成不同[3]，兩種藥材功效也有所區(qū)別，甚至同一種藥材由于不同產(chǎn)地導(dǎo)致的生長環(huán)境等條件差異也會產(chǎn)生化學(xué)成分含量的差異從而影響功效，所以現(xiàn)今市場上銷售的金銀花、山銀花藥材質(zhì)量不一，藥用價(jià)值良莠不齊。學(xué)科研究一般通過指紋圖譜來區(qū)分不同藥材，評價(jià)藥材質(zhì)量，常用的指紋圖譜研究方法有HPLC法、GC法、紅外光譜法、NMR法和生物學(xué)研究方法等。

1 指紋圖譜的研究

1.1 HPLC指紋圖譜

HPLC指紋圖譜是利用高效液相色譜儀，將中藥中的不同極性成分在流動相洗脫下分別被檢測，最終以不同峰的形式反映成圖譜的方式，是最為常見的指紋圖譜研究方法。馮華[4]等人對5批基地和8批不同產(chǎn)地山銀花藥材進(jìn)行指紋圖譜分析，建立了山銀花藥材的HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了12個共有峰，為山銀花藥材品質(zhì)鑒定和質(zhì)量監(jiān)控提供了科學(xué)依據(jù)。范毅[5]等人建立了道地產(chǎn)區(qū)和主產(chǎn)區(qū)的15批金銀花指紋圖譜，相似度0.94以上，發(fā)現(xiàn)12個共有峰，并指認(rèn)出新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、馬錢苷、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C 8個共有峰。通過對綠原酸和木犀草苷進(jìn)行含量測定發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地的金銀花成分基本一致，但各成分含量有一定差異，為金銀花成分研究和質(zhì)量評價(jià)提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。鄧寒霜[6]等人建立了13批樹型金銀花和12批野生金銀花的HPLC指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)野生金銀花共有峰數(shù)目為樹型金銀花的2.2倍，說明野生金銀花含有更多化學(xué)成分，通過計(jì)算兩種金銀花指紋圖譜的相似度，測定各批次金銀花綠原酸、異綠原酸和木犀草苷含量，發(fā)現(xiàn)人工栽培的樹型金銀花指紋圖譜的穩(wěn)定性更好一些，成分含量也較為相似，而野生金銀花表現(xiàn)出較大差異，反映規(guī)范栽培對藥材質(zhì)量穩(wěn)定均一有著重要作用。

山銀花中含有的皂苷成分在金銀花中含量少或幾乎沒有，只能通過蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)檢測出來。晏薇娜[7]建立了不同產(chǎn)地的12 批金銀花 HPLC-DAD指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)12批金銀花藥材指紋圖譜相似度0.8以上，并指認(rèn)出7個共有峰；建立了產(chǎn)自貴州的30批山銀花 HPLC-DAD-ELSD指紋圖譜，發(fā)現(xiàn)27批山銀花藥材指紋圖譜相似度0.9以上，并指認(rèn)出11個共有峰，通金銀花與山銀花指紋圖譜研究和成分對比發(fā)現(xiàn)，山銀花中無咖啡酸，但多了三種皂苷物質(zhì)，為金銀花和山銀花的對比性研究提供依據(jù)。

1.2 GC指紋圖譜

氣相色譜法是一種在有機(jī)化學(xué)中對易于揮發(fā)而不發(fā)生分解的化合物進(jìn)行分離與分析的色譜技術(shù)，多用于沸點(diǎn)較低的化學(xué)成分的分析，適用于金銀花和山銀花中揮發(fā)油、多糖等易揮發(fā)成分的檢測研究。宋興良、呂莉[8]采用氣-質(zhì)聯(lián)用的方法對金銀花揮發(fā)油進(jìn)行GC/MS分析，并建立指紋圖譜。比較山東平邑和安徽兩產(chǎn)地金銀花揮發(fā)油組成和含量的差異，證實(shí)山東平邑金銀花比安徽產(chǎn)金銀花含有更多香葉醇和β-芳樟醇，說明山東平邑產(chǎn)金銀花有著更強(qiáng)的抗菌活性。丁潔[9]等人采用氣相色譜法(GC)，建立了12批金銀花多糖樣品的指紋圖譜，指認(rèn)了鼠李糖、阿拉伯糖、巖藻糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖、肌醇六乙酸酯等7個共有峰，各批次樣品的相似度0.994以上，最后通過聚類分析主成分分析將12批金銀花分為兩類，以主產(chǎn)于山東的S12品質(zhì)最好，主產(chǎn)于河南的S5品質(zhì)次之，主產(chǎn)于吉林的S11最末，證實(shí)不同的氣候環(huán)境會導(dǎo)致金銀花質(zhì)量產(chǎn)生差異，為金銀花藥材的質(zhì)量評價(jià)提供參考。

1.3 IR指紋圖譜

紅外吸收光譜法(IR)是利用物質(zhì)對紅外線的特征吸收建立起來的分析方法，具有快速、高效、取樣量小的特點(diǎn)，與HPLC法比成本低且更節(jié)省時(shí)間。鄒婧[10]等人通過傅立葉紅外光譜法建立了來自五個不同產(chǎn)地的10批金銀花樣品的指紋圖譜，并對原始樣品圖譜做一階求導(dǎo)和二階求導(dǎo)計(jì)算，結(jié)果表明10批樣品圖譜存在差異，可通過一階圖譜和二階圖譜對不同產(chǎn)地樣品進(jìn)行區(qū)分，可為不同產(chǎn)地金銀花的鑒定提供技術(shù)支撐。劉濤[11]等人建立了10批金銀花樣品和山銀花樣品的紅外指紋圖譜，并建立了紅外指紋圖譜共有峰率和變異峰率雙指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)金銀花和山銀花樣品的變異峰率大于共有峰率，表明二者內(nèi)在質(zhì)量存在差異，為金銀花和山銀花的對比研究提供新思路。

1.4 NMR指紋圖譜

核磁共振波譜法是研究處于強(qiáng)磁場中的原子核對射頻輻射的吸收，從而獲得有關(guān)化合物分子結(jié)構(gòu)信息的分析方法，對中藥材的質(zhì)量鑒定具有重要意義。盧鳳來[12]等人采用質(zhì)子核磁共振法(1H-NMR)建立了5批金銀花和3批山銀花的指紋圖譜，不同產(chǎn)地的金銀花和山銀花各自批次間特征性化學(xué)成分在相對組成和結(jié)構(gòu)方面保持一致，但兩種藥材間差異較大，主要體現(xiàn)在高場區(qū)(δ0.5～3.0)和糖端基質(zhì)子區(qū)(δ3.0～5.5)，通過聚類分析可將兩者區(qū)分開，為金銀花和山銀花的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1.5 生物指紋圖譜

中藥生物指紋圖譜利用不同種藥材遺傳多樣性的特點(diǎn)，通過基因技術(shù)尋找相同的DNA片段進(jìn)行測序，以此構(gòu)建生物指紋圖譜，達(dá)到從基因分子層面鑒別藥材的目的。徐石勇[13]等人利用 SSR標(biāo)記技術(shù)，構(gòu)建6批忍冬藥材基于3個SSR位點(diǎn)的分子指紋圖譜，遺傳多樣性分析發(fā)現(xiàn)6批忍冬藥材中金銀花與山銀花的遺傳距離較遠(yuǎn)，證明該指紋圖譜可用于鑒別金銀花和山銀花。然后對三個不同產(chǎn)地的87批樣品進(jìn)行 PCR-SSR 檢測及聚類分析，結(jié)果顯示，三個產(chǎn)地的樣品均為金銀花，且其中兩產(chǎn)地金銀花品種親緣關(guān)系很近。

2 譜效關(guān)系研究

2.1 金銀花和山銀花的化學(xué)成分及藥理作用

金銀花和山銀花是歷史悠久的常用中藥，含有豐富的化學(xué)成分，具有廣泛的功效。金銀花和山銀花的化學(xué)成分主要包括有機(jī)酸類、揮發(fā)油類、黃酮類、環(huán)烯醚萜苷類、皂苷類等成分[14][15][16][17]，具有抗炎[18-20][19][20、抗病毒[21-[22[23、抗菌[24-][25[26、抗腫瘤[27[28-][29、清除自由基[30-][31等作用。

2.2 抗炎抗菌作用譜效關(guān)系的研究

抗炎譜效關(guān)系的研究大多通過建立二甲苯致小鼠耳腫脹炎癥模型或RAW264.7細(xì)胞炎癥模型來探討特征峰與抗炎抗菌活性之間的關(guān)聯(lián)性[32][33[34][35]。白仲杰[36]建立了山銀花甲醇提取液HPLC指紋圖譜，結(jié)合RAW264.7細(xì)胞炎癥模型實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用偏最小二乘回歸分析結(jié)果，最后確定10個共有峰對山銀花抗炎活性貢獻(xiàn)較大，其中三個共有峰分別為綠原酸、隱綠原酸A、異綠原酸；鄒璐[37]建立山銀花甲醇提取液HPLC指紋圖譜，利用抗炎抗菌模型，針對不同抗炎抗菌對象，采用偏最小二乘回歸分析法和灰色關(guān)聯(lián)度分析法確定相應(yīng)的藥效峰，得出結(jié)論綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B和異綠原酸C對抗菌抗炎活性貢獻(xiàn)最多。廖艷燕[38]等人通過建立金銀花水提液HPLC指紋圖譜及二甲苯致小鼠耳腫脹炎癥模型，采用偏最小二乘回歸分析法和灰色關(guān)聯(lián)度分析法研究其抗炎活性譜-效關(guān)系，確定23個共有峰對抗炎活性有貢獻(xiàn)作用，并指認(rèn)出其中9個共有峰分別為蘆丁、金絲桃苷、異綠原酸B、木犀草素、綠原酸、馬錢苷、新綠原酸、異綠原酸C、異綠原酸A。

2.3 抗流感病毒作用譜效關(guān)系的研究

郭成軍[39]等人在已建立的金銀花指紋圖譜基礎(chǔ)上，運(yùn)用指紋圖譜相似度評價(jià)方法對正常小鼠、流感模型小鼠血清指紋圖譜進(jìn)行比較，找出金銀花抗流感作用的藥效峰。米慧娟[40]等人建立40批金銀花水提液HPLC指紋圖譜，并測定藥液抑制甲流病毒的IC50，利用The Unscrambler 軟件，采用偏最小二乘法對指紋圖譜數(shù)據(jù)和IC50進(jìn)行譜-效相關(guān)性分析，建立金銀花抗流感病毒譜-效相關(guān)性評價(jià)模型，可以通過指紋圖譜數(shù)據(jù)來評價(jià)金銀花抗甲流病毒的生物活性；劉佳[41]建立金銀花和山銀花水提液HPLC指紋圖譜，試驗(yàn)得到藥物體外抗流感病毒數(shù)據(jù)，利用偏最小二乘法分析進(jìn)行相關(guān)性分析并通過多元線性回歸建立譜效關(guān)系模型，找出金銀花和山銀花抗流感病毒的藥效峰。

2.4 抗腫瘤譜效關(guān)系的研究

隨著生活節(jié)奏加快，惡性腫瘤病癥高發(fā)，通過研究抗腫瘤譜效關(guān)系，為尋求抑制腫瘤的合適藥材，以及對相應(yīng)藥材質(zhì)量控制都起著重要作用。萬丹[42]等人建立金銀花和山銀花正丁醇提取物HPLC-MS/MS圖譜，確認(rèn)相關(guān)峰物質(zhì)成分，結(jié)合提取液抑制腫瘤活性的數(shù)據(jù)，利用最小二乘法分析其譜效關(guān)系，最終確認(rèn)斷氧化馬錢子苷、3，4-二咖啡?？鼘幩?、川續(xù)斷皂苷乙是金銀花和山銀花提取物主要抗腫瘤作用來源。

2.5 抗氧化譜效關(guān)系的研究

已有研究證明，金銀花和山銀花中綠原酸類物質(zhì)具有一定抗氧化作用[43]。王磊[44]通過不同方式篩選具有抗氧化活性的金銀花組分，結(jié)合UPLC指紋圖譜發(fā)現(xiàn)兩個峰表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抗氧化活性，推斷其為異綠原酸類咖啡?？崴犷愇镔|(zhì)。梁叢蓮[45]等人建立了金銀花甲醇提取液HPLC指紋圖譜和提取液對DPPH自由基的清除方程，通過變量相關(guān)分析得到其譜效關(guān)系，最終確認(rèn)綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸C都是金銀花抗氧化的藥效成分；Rong-rong Zhou[46]等人采用HPLC-DAD / MS-DPPH的方法研究了5種金銀花樣品的抗氧化活性，并使用主成分分析和線性回歸分析樣品抗氧化活性與具體化合物之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)金銀花中5-O-咖啡酰奎寧酸，4-O-咖啡酰奎寧酸，-5-O-咖啡?？鼘幩峒柞?，1，4-二-O-咖啡酰奎寧酸和3，4，5-三-O-咖啡?？鼘幩釋寡趸δ芫哂兄匾饔谩?/p>

3 結(jié)語

由于中藥材本身成分的復(fù)雜性，不同產(chǎn)地、不同環(huán)境、不同培養(yǎng)方式的藥材在組成和成分含量上或多或少存在差異，可能導(dǎo)致使用藥材后沒有預(yù)期的療效，甚至產(chǎn)生別的副作用的風(fēng)險(xiǎn)，對于用藥穩(wěn)定均一的要求來說這是一個急需解決的問題。中藥指紋圖譜的出現(xiàn)為藥材質(zhì)量鑒定，規(guī)范藥材在市場上的流通有著一定的促進(jìn)作用。

金銀花和山銀花組成不一，療效也隨之不同，但市場上兩種藥材混賣的情況較為普遍，藥材中含有的重金屬也對人體有著危害風(fēng)險(xiǎn)[47]，指紋圖譜的研究給金銀花和山銀花藥材質(zhì)量控制提供有益借鑒。金銀花和山銀花中的主要藥效成分是綠原酸，所以具有高效、快速特點(diǎn)，對綠原酸有著高響應(yīng)值的液相色譜指紋圖譜是研究組成差異首選方式，譜效關(guān)系的研究也幾乎都是采用該方法，但目前對于譜效關(guān)系的研究還不夠深入。相對來說，在金銀花和山銀花抗炎譜效關(guān)系上的研究更多，得出的成果也更全面。當(dāng)前能夠明確的是，綠原酸和類綠原酸類物質(zhì)對金銀花和山銀花藥材抗炎活性起著主要的作用，這一點(diǎn)與2015年版《中國藥典》將綠原酸作為金銀花和山銀花含量測定的指標(biāo)是一致的。對于兩種藥材抗腫瘤、抗流感、抗氧化、保肝、調(diào)節(jié)血脂作用的物質(zhì)基礎(chǔ)現(xiàn)在了解并不特別清楚，這一方面的研究或可從借助其他色譜研究方式的角度作為突破口來尋找答案，現(xiàn)已成為下一步需要攻克的難題，以期更全面的了解決定藥材質(zhì)量的成分，從而控制藥材質(zhì)量均一性、穩(wěn)定性，鑒別藥材真假和優(yōu)劣。