體外診斷試劑干擾物質的研究探討

周游 上海市醫(yī)療器械化妝品審評核查中心 （上海 200020）

內容提要： 對臨床實驗室檢測的干擾會造成檢測結果的不一致，從而對患者造成困惑和傷害。實驗室通常無法輕易檢測到由干擾引起的誤差。為了避免這個問題，制造商應在產(chǎn)品設計階段進行充分的干擾物質研究。常見的干擾包括血紅蛋白、膽紅素和脂質、類風濕因子、生物素等。文章對常見干擾物質的干擾機制進行總結，并結合審評經(jīng)驗，剖析干擾物質的研究關注點，供相關從業(yè)人員進行參考。

在體外診斷試劑的分析系統(tǒng)中，一個物質錯誤地引起示值的增加或減少而改變檢測結果，這個物質被稱為干擾物質。干擾物質可能會引起臨床診斷及治療的錯誤，對患者產(chǎn)生不利的結局。雖然臨床實驗室通過內部質量控制和外部質量評估程序可以對結果進行檢查，但通常不容易檢測到干擾引起的錯誤。因此，體外診斷試劑廠商應對干擾進行充分的重視和研究，提升分析系統(tǒng)的特異性。本文旨在討論常見的干擾物質類型以及可能導致的體外分析干擾機制，結合相關審評經(jīng)驗，闡述干擾物質研究要點及常見問題，為研發(fā)與注冊申報人員提供參考。

1.臨床上常見的干擾物質及干擾機制

干擾分為內因干擾和外因干擾。內源性干擾來自患者自身樣本中存在的物質，如溶血（血紅蛋白等物質）、膽紅素、脂類、蛋白質、抗體等。外源性干擾是指被引入患者樣本的物質（如常用藥物、其代謝物或藥物制劑中的添加劑等）、患者攝入的物質（如酒精、營養(yǎng)添加劑等）、以及樣本采集、運輸、處理過程中引入的干擾，如溶血、防腐劑、抗凝劑等。還應該考慮到文獻上已經(jīng)報道過的干擾同類試劑或者測量程序的物質。申請人應當結合產(chǎn)品特點，篩選出可能干擾物質予以研究。

1.1 溶血

溶血歷來被認為是影響生化結果的最常見的分析前錯誤。溶血是由紅細胞膜的破壞引起的。紅細胞脆性較大，對切向應力敏感。據(jù)研究表明，在特定人群，如糖尿病、多發(fā)性硬化癥和絕經(jīng)后女性中，紅細胞的機械脆性增加[1]。兩種主要的溶血類型包括體內溶血和體外溶血。體內溶血可能由于手術或藥物原因導致，體外溶血多由物理因素（機械性破壞、冷凍）引起。在體外溶血中，由于不當操作，如針頭過小導致紅細胞通過針尖時被破壞、抗凝時用試管搖晃太劇烈、標本存放溫度不合適或在運輸過程中處理不當導致紅細胞被破壞。

溶血可能通過多種機制干擾生物化學結果。主要分為改變樣品中分析物濃度和干擾分析物測量兩種途徑。①由于許多物質在紅細胞內外存在較大濃度差，因此紅細胞內內容物的釋放會改變測定結果。一些紅細胞內本身包含的高濃度物質，如血紅蛋白、鎂、天冬氨酸轉氨酶等物質會使測值升高，而紅細胞內濃度較低的物質，檢測結果會由于細胞內液的稀釋作用而錯誤降低。②氧合和脫氧血紅蛋白的吸光度光譜略有不同，但在415nm附近顯示最大吸光度，在320～450nm和540～580nm有較為顯著吸光度[2]。因此，在這些范圍內使用基于吸光度測量的比色測定法更容易受到干擾。③溶血也可能引起與分析反應的酶的釋放。例如，腺苷酸環(huán)化酶對肌酸激酶測定產(chǎn)生干擾[3]。除此之外，溶血引起的負干擾和正干擾相互作用也可能形成綜合干擾。

1.2 膽紅素

膽紅素存在于人類膽汁中的主要色素，呈棕黃色。膽紅素在生物體內起著重要的生理作用，并且與多種生物過程密切相關。一般膽紅素的升高多由肝臟疾病引起。膽紅素吸收的光在400～540nm，峰值在460nm左右，在這些波長處進行初級或次級吸光度測量的比色測定可能會受到一定影響[4]。膽紅素的抗氧化特性使其能夠與過氧化氫反應，這是黃疸干擾的另一種機制。過氧化氫是一些常見化學檢測（包括膽固醇、甘油三酯、尿酸和酶促肌酐）的中間產(chǎn)物，因此容易受到黃疸干擾[5,6]。

1.3 高血脂癥

高脂血癥是一種病理狀態(tài)，其特征是患者血漿中至少有一種脂質成分高于正常范圍，這通常是由于患者的脂肪轉運或代謝功能出現(xiàn)異常所引發(fā)的。在這種情況下，乳糜血的出現(xiàn)頻率增加，其表現(xiàn)形式為血漿呈乳白色或渾濁，血液中的脂肪含量顯著增加。

乳糜顆粒是乳糜血中的主要成分，主要由脂蛋白、膽固醇和三酰甘油構成。這些顆粒的存在會對血液檢測產(chǎn)生一定的干擾作用，主要包括以下幾個方面：首先，乳糜顆粒會導致光散射，從而產(chǎn)生測量誤差；其次，乳糜顆粒的存在會占據(jù)一定的體積，體積減少導致水相減少；最后，脂肪顆粒會大量吸附在紅血球上，不僅使溶血速度降低，而且對紅血球的實際數(shù)量下降、白血球增多等紅血球的檢查結果也會產(chǎn)生影響[7]。

1.4 類風濕因子

類風濕因子（Rheumatoid Factor，RF）是一種在臨床上常見的自身抗體，是內源性人抗體結合人γ球蛋白。RFs表現(xiàn)出對聚集的γ球蛋白的優(yōu)先結合，并參與免疫復合物的清除機制。然而，類風濕因子在檢測過程中可能對一些檢查系統(tǒng)產(chǎn)生干擾，造成檢測結果的不正確。

RF主要是針對IGG Fc區(qū)的天然抗體。在標準的雙位點夾心免疫分析中，RF的干擾可能是正向或負向的。當RF與捕獲抗體結合時，會形成空間位阻，可能導致錯誤的抑制結果。當RF結合檢測抗體時可能會導致錯誤的升高結果。因此，在進行類風濕因子檢測時，需要考慮到這種干擾因素，并采取相應的措施來消除或減小這種干擾，以確保檢測結果的準確性[8]。

1.5 生物素

生物素與鏈親和素之間的相互作用是生物體內蛋白質與配體之間最強烈的非共價結合之一，這種結合具有快速形成、耐受極端溫度、pH值和變性劑的特性。其鍵結形成迅速，耐極端溫度、pH值和變性劑。因此，生物素-鏈霉親和素偶聯(lián)是體外診斷測試的常見組成部分，有助于檢測和靶向生物分析物。然而，血液中高生物素含量會導致檢測結果的不準確。飲食生物素攝入通常不會導致血液生物素濃度超過體外診斷試驗的干擾閾值。然而，最近大劑量生物素補充劑的趨勢出現(xiàn)了對免疫測定的干擾現(xiàn)象。所有基于生物素的免疫分析都容易受到生物素的干擾。根據(jù)生物素劑量、試驗設計和試驗干擾閾值的不同，生物素干擾可能導致假低（夾心免疫測定）或假高（競爭性免疫測定）結果[9,10]。

2.干擾物質的研究關注點

以審評經(jīng)驗來看，申報資料干擾試驗大多缺乏科學性。常見的問題有：試驗條件無法覆蓋說明書聲稱內容，分析物濃度未包含醫(yī)學決定水平或參考區(qū)間上/下限附近、干擾物濃度選擇不合理或添加方式不合理等。

有關干擾試驗的試驗方案設計有：中華人民共和國醫(yī)藥行業(yè)標準WST 416-2013《干擾實驗指南》、CLSI發(fā)布的《EP7-A2:Interferencetestinginclinicalchemistry;approved guideline-secondedition》《定量檢測體外診斷試劑分析性能評估注冊審查指導原則》等?？刹捎锰砑痈蓴_物質的樣本進行研究方法，或者通過申報試劑和不受該干擾物影響的測量程序檢驗結果間的比對有代表性的患者樣本，進行干擾物質研究。

2.1 添加干擾物質的研究

干擾試驗一般可采用配對比對的方式，即采用添加干擾物質的樣本進行研究（添加的干擾物體積應不影響反應體系的整體基質），比較干擾樣本和不包含或含正常濃度水平干擾物樣本檢測結果間差異。如果差異超出接受范圍，再進一步研究該干擾物質的濃度水平。

在干擾物的篩選過程中，需要根據(jù)產(chǎn)品的具體特性進行深入的分析和選擇。包括：在病理條件下產(chǎn)生的代謝物，在患者治療過程中引入的化合物（如藥物、血漿擴張劑和抗凝血劑）、患者攝入的物質，在標本制備過程中添加的物質等。在進行試驗之前，必須確保試驗的客觀性。研究人員需要根據(jù)分析物的醫(yī)療用途來設定干擾物的總允許誤差，以此來判斷一定濃度的干擾物是否可以被接受。這個總允許誤差可以參考我國國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心臨床檢驗室間質量評價計劃中的相關規(guī)定，或者根據(jù)臨床專家的實踐經(jīng)驗，經(jīng)過廣泛的討論，制定相關的標準。此外，也可以根據(jù)生物學變異或分析變異來確定總允許誤差。

在分析物試驗濃度的選擇上，建議使用至少兩個分析物水平的樣本，這些濃度應在醫(yī)學決定水平或參考區(qū)間的上下限附近。當需要明確干擾物質濃度與干擾程度之間的關系時，往往需要納入更多分析物濃度的樣本。對于干擾物試驗濃度來說，常見可能內源性干擾物的建議試驗濃度可參考《干擾實驗指南》附錄C或CLSI-EP7-A2文件附錄D（appendixD.InterferenceTestConcentrationsforEndogenous Analytes）。內源性干擾物一般為目標人群中預期的最高濃度。在確定檢測次數(shù)的過程中，需要綜合考慮多個因素，包括被評估方法的批內重復性標準差、試驗濃度下的干擾標準以及置信水平等。通過運用統(tǒng)計學方法進行計算，以最終確定合適的檢測次數(shù)。

在數(shù)據(jù)處理與分析中，可通過試驗樣本與對照樣本的偏差標識干擾結果dobs，然后根據(jù)無效假設值（dnull，通常為0）、對雙邊檢驗100(1-α)%置信水平時正態(tài)分布的百分數(shù)（z(1-α/2)）、被評價方法的批內重復性標準差s以及樣本重復次數(shù)n來計算界值dc。見公式（1）～（3）。

其中：t0.975,n-1是自由度為n-1,t分布97.5%的概率密度值。

根據(jù)計算結果，如果dobs≤dc，那么可以認為在當前濃度下，該物質并未對評價產(chǎn)生明顯的干擾作用。然而，如果dobs＞dc，那么就應當認為在當前濃度下，該物質存在顯著的干擾影響。

2.2 使用患者標本評估干擾

在試驗設計中，還可以基于兩組患者標本（檢測組和對照組）進行分析，這兩組標本應分別使用被評估的檢測方法、參考檢測方法或其他合格的對比檢測方法進行比較。在此過程中，已知對干擾敏感度較低的參考檢測方法被用來在對比研究中建立“真值”。為了保證試驗的可靠性，檢測標本應來源于具有特定疾病、服用特定藥物或其他已知組成成分的目的患者群體。而對照組樣本則應來自無相關疾病、未服用相關藥劑的人群，且其待分析物的分布應與檢測標本基本一致。

在數(shù)據(jù)分析階段，應主要判斷對比檢測方法中由干擾引起的差異是否顯著，以及干擾形成偏差的方向。然而，需要注意的是，利用患者標本評估干擾的方法僅能建立干擾與偏差之間的關聯(lián)關系，而不能確定干擾物的具體來源。真實的干擾物可能是恰巧與疑似干擾物同時存在的物質。比如，由于疾病產(chǎn)生的生化代謝物引起的干擾可能會被錯誤地歸結為用于治療疾病的藥物。

3.小結與展望

隨著新療法的發(fā)展，新的干擾物質也不斷出現(xiàn)。隨著越來越多的檢測方法被開發(fā)出來，更多的物質也可以被檢測。在降低試劑的干擾方面，醫(yī)療器械廠商需要深入和專業(yè)的調查，可在檢測設計、抗體的結構和特異性以及信號產(chǎn)生和檢測方面進行改進，以提升試劑的抗干擾性能。