結(jié)核分枝桿菌生物膜的研究進(jìn)展

宋善敏，甘夢蘭，魏怡冰，王恩花

(貴州農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院，貴州 貴陽 551400)

結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium Tuberculosis，MTB)引起的一種慢性傳染性疾病，具有發(fā)病率高、感染性強(qiáng)、致死率高、高耐藥性等特點(diǎn)，以肺部結(jié)核最為常見。據(jù)WHO發(fā)布的《2020年全球結(jié)核病調(diào)查報(bào)告》顯示[1]，2019年，全球新發(fā)結(jié)核病患者約1 000萬，發(fā)病率為13/萬，且約有3.3%的新發(fā)患者和17.7%的復(fù)治患者對利福平耐藥。目前，結(jié)核病普遍采用6～9個(gè)月的短程督導(dǎo)治療(DOTs)[2]，大多數(shù)患者可以被治愈，但因結(jié)核病治療過程中存在治療周期長、不規(guī)范用藥、患者依從性差等因素，導(dǎo)致耐藥性結(jié)核桿菌出現(xiàn)，給全球結(jié)核病控制帶來了極大挑戰(zhàn)。

研究表明，細(xì)菌形成生物膜會增強(qiáng)細(xì)菌對宿主免疫系統(tǒng)的抵抗力，且大幅增加抗生素的耐藥性(提高10～1 000倍)[3]，大約65%～80%的人類細(xì)菌感染與生物膜形成相關(guān)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)MTB能夠長期棲居于生物膜內(nèi)，成為持留菌，可能是引起結(jié)核分枝桿菌耐藥性增加的重要機(jī)制之一。本文就MTB生物膜的概念、形成機(jī)制、結(jié)構(gòu)特性、致病性及新研究思路等方面進(jìn)行簡要綜述。

1 細(xì)菌生物膜的概念

細(xì)菌生物膜( bacterial biofilm，BBF)是細(xì)菌為了適應(yīng)自然環(huán)境，在生長過程中粘附在附著物表面或破損組織表面而形成的特殊存在形式，是由多個(gè)細(xì)菌組成的一種膜狀結(jié)構(gòu)[5]。結(jié)核分枝桿菌在適宜生長的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時(shí)間后，在氣液交接面會形成有組織、緊密連接的薄膜樣結(jié)構(gòu)，即結(jié)核分枝桿菌生物膜[6]。

2 MTB生物膜的形成機(jī)制

MTB生物膜的形成是一個(gè)非常復(fù)雜的動態(tài)過程，主要有四個(gè)步驟[7]。

2.1 黏附階段

初始附著是細(xì)菌形成生物膜最關(guān)鍵的步驟，浮游細(xì)菌在疏水性、表面張力及群體感應(yīng)(QS)的作用下，不斷向生物或非生物附著表面靠近。同時(shí)，克服來自宿主本身的排斥力，完成初始附著，是一個(gè)動態(tài)的、可逆的和有選擇特異性的黏附過程。

2.2 增殖階段

細(xì)菌在表面附著后，大量分泌細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，ECM包含蛋白質(zhì)、無機(jī)鹽、脂質(zhì)、多糖、細(xì)胞外DNA、和RNA等物質(zhì)，是細(xì)菌長期營養(yǎng)缺乏期間的營養(yǎng)來源。此時(shí)細(xì)菌快速生長繁殖并分泌胞外多糖(EPS)，促使細(xì)菌之間相互聚集、增加細(xì)菌黏附的牢固程度，不斷粘結(jié)浮游細(xì)菌，形成微小菌落。

2.3 成熟階段

形成微小菌落后，EPS不斷粘連微小細(xì)菌，使生物膜加厚，最終形成一個(gè)緊密結(jié)合、相互連接的三維(3D)立體薄膜結(jié)構(gòu)，包括水通道和氣孔等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，作為營養(yǎng)物質(zhì)、水分、代謝產(chǎn)物的運(yùn)輸通道。

2.4 分散階段

細(xì)菌形成成熟生物膜后，細(xì)菌不斷聚集累積，生存環(huán)境變得擁擠，在基因調(diào)控和外部沖刷力作用下，部分細(xì)菌會解聚和脫離，重新變成浮游細(xì)菌，尋找新的黏附表面，重復(fù)初始附著、生長增殖、生熟分散這一過程，這也是導(dǎo)致細(xì)菌擴(kuò)散感染的重要原因。

3 MTB的結(jié)構(gòu)特性

MTB生物膜的形成過程、調(diào)控方式、耐藥機(jī)制之所以十分復(fù)雜，是因?yàn)樯锬ぞ哂屑?xì)胞表面疏水性、流動性、不對稱性、選擇通透性和單純擴(kuò)散等結(jié)構(gòu)特性。Cohengonsaud等[8]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面疏水性是決定細(xì)菌黏附的關(guān)鍵，其賦予了細(xì)菌表面的粘附性，是生物膜的形成和導(dǎo)致致病性的基礎(chǔ)。楊福愉等[9]發(fā)現(xiàn)，生物膜上大部分類脂、膜蛋白分子處于不斷流動狀態(tài)，可以影響物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞運(yùn)動和信息傳遞等。細(xì)菌生長所需要的營養(yǎng)物質(zhì)及其他必須物質(zhì)，進(jìn)入生物膜內(nèi)取決于膜兩側(cè)濃度差，并以單純擴(kuò)散方式過膜。

4 MTB生物膜與致病性的關(guān)系

4.1 影響藥物敏感性

膜內(nèi)菌與浮游細(xì)菌相比，EPS可選擇性的通過無機(jī)鹽和營養(yǎng)物質(zhì)，造成膜內(nèi)微環(huán)境差異，例如局部營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、形成厭氧環(huán)境等，使膜內(nèi)菌出現(xiàn)部分被殺死、部分生長緩慢或休眠等情況，極大降低了對抗生素藥物的敏感性，必須加大給藥量，表現(xiàn)出更高的耐藥性。

4.2 對抗機(jī)體免疫防御

浮游細(xì)菌很容易被人體自身免疫系統(tǒng)清除或被高濃度抗生素殺死，但膜內(nèi)持留菌在生物膜的保護(hù)下，抗生素被屏蔽，濃度不足以殺死膜內(nèi)菌，且可以逃避吞噬細(xì)胞吞噬或?qū)顾拗髅庖呦到y(tǒng)攻擊。膜內(nèi)細(xì)菌繼續(xù)以低代謝、休眠狀態(tài)存活，但當(dāng)抗生素壓力降低或環(huán)境再度適宜生存時(shí)，膜內(nèi)菌結(jié)束休眠并恢復(fù)生長，再次散播感染病灶，造成結(jié)核病的復(fù)發(fā)。

5 以MTB生物膜為靶點(diǎn)縮短結(jié)核治療時(shí)間的新思路

5.1 抑制MTB生物膜的形成

MTB生物膜EPS中富含脂質(zhì)游離分枝菌酸、多糖、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)等，通過干擾關(guān)鍵組分，抑制生物膜形成。Xavier等[10]發(fā)現(xiàn)酯酶、多糖解聚酶等的促解離劑可能會破壞EPS合成，影響細(xì)菌黏附；Ojha等[11]發(fā)現(xiàn)基因GroEL1參與恥垢分枝桿菌生物膜分枝菌酸合成，突變后會影響MTB細(xì)胞壁形成；Trivedi等[12]發(fā)現(xiàn)MTB關(guān)鍵多糖纖維素的降解干擾EPS合成，減弱微小細(xì)菌的附著，進(jìn)一步影響或破壞生物膜的形成。

5.2 影響MTB生物膜的生長

MTB生物膜的生長過程受多種環(huán)境因素影響，包括溫度、滲透壓、pH和CO2等，通過改變生長環(huán)境，影響MTB生物膜生長。Ojha等[ 13]建立了MTB生物膜體外培養(yǎng)模型，發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中CO2積累達(dá)44 amu時(shí)，會刺激生物膜生長；Banin 等[14]研究發(fā)現(xiàn)鐵在生物膜的形成中起關(guān)鍵作用，Ojha等[ 15]進(jìn)一步研究證明，低含量鐵和鋅都能抑制MTB生物膜生長發(fā)育。

5.3 清除MTB成熟生物膜

對于成熟生物膜，通過影響EPS結(jié)構(gòu)，減弱生物膜的結(jié)構(gòu)質(zhì)量，可加速生物膜降解和清除，但目前MTB生物膜降解清除相關(guān)研究較少。肖倩等[16]發(fā)現(xiàn)中藥黃芪、穿心蓮及抗菌肽LL-37單獨(dú)應(yīng)用均能夠早期抑制銅綠假單胞菌生物膜的形成，在一定程度上可清除成熟的生物膜；You等[17]、何谷良等[18]研究發(fā)現(xiàn)鹽膚木乙醇提取物MIC值高于0.05 g/L、黃芩提取物黃芩苷高于0.5 g/L時(shí)，對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌生物膜(MRSA)均有顯著的清除作用。

6 結(jié)語

目前，盡管在結(jié)核病基礎(chǔ)治療、預(yù)防及診斷等方面研究均有很多突破，但結(jié)核病治療形勢依然嚴(yán)峻，耐藥結(jié)核病愈演愈烈，結(jié)核病依舊是最具破壞性的細(xì)菌性疾病之一。在結(jié)核病治療中，一旦形成生物膜，膜內(nèi)MTB會以低代謝、休眠狀態(tài)存活，逃逸宿主的免疫清除，導(dǎo)致細(xì)菌對異煙肼和利福平的耐藥性會大幅度提高，延長疾病治療時(shí)間。通過有效抑制MTB生物膜形成、生長，或清除已有生物膜以縮短結(jié)核治療時(shí)間是治療結(jié)核病的新思路。但MTB生物膜的形成機(jī)制與體內(nèi)生長環(huán)境、免疫系統(tǒng)的關(guān)系尚未明確，相關(guān)研究也僅局限于體外實(shí)驗(yàn)。因此，今后我們?nèi)孕韪钊胙芯縈TB生物膜相關(guān)方面，爭取早日攻克這一難題。