微囊藻毒素降解酶MlrA的結(jié)構(gòu)功能分析

潘禹，王華生，詹鴻峰，孫緩緩，范超，劉祖文，閆海

（1 江西理工大學(xué)土木與測繪工程學(xué)院，江西贛州341000； 2 北京科技大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100083）

引 言

隨著水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象加劇，淡水藍(lán)藻水華暴發(fā)形勢愈發(fā)嚴(yán)峻[1]。微囊藻毒素(microcystins, MCs)是水華暴發(fā)期間檢出頻率最高、危害最為嚴(yán)重的肝毒性藍(lán)藻毒素[2-3]。MCs 由7 個(gè)氨基酸組成，結(jié)構(gòu)通式 為 環(huán) - (Ala(1)-X(2)-MeAsp(3)-Z(4)-Adda(5)-Glu(6)-Mdha(7))，見圖1。由于非保守位置(X 和Z)可變L-氨基酸的不同，以及MeAsp基團(tuán)和Adda基團(tuán)的甲基化和去甲基化差異，MCs 可形成超過200 種同分異構(gòu)體，以MC-LR和MC-RR毒性最大且含量最高[4]。

交替雙鍵和環(huán)狀結(jié)構(gòu)使MCs 在自然環(huán)境中保持高度穩(wěn)定，對多數(shù)化學(xué)藥劑與常見蛋白水解酶具有抗性，甚至在煮沸或極端pH 條件下仍不變性失活[4]。盡管如此，已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)了部分水生細(xì)菌對MCs 具有生物降解活性。目前，已從生態(tài)系統(tǒng)中分離表征出70 多株MCs 降解菌[5]，并通過DNA 文庫篩選與基因異源表達(dá)鑒定出功能水解酶MlrABCD[6]。MlrA(或稱為微囊藻毒素降解酶microcystinase)首先攻擊MC-LR 的Arg-Adda 肽鍵，產(chǎn)生低毒線性產(chǎn)物(H-HN-Adda-Glu-Mdha-Ala-Leu-MeAsp-Arg-OH)；接著胞內(nèi)酶MlrB 識(shí)別并水解線性MC-LR 的Ala-Leu 肽鍵，生成四肽(Adda-Glu-Mdha-Ala-OH)；最后胞內(nèi)金屬酶MlrC 將四肽的Adda-Glu 肽鍵水解，生成最終產(chǎn)物Adda。MlrD 暫推定為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，負(fù)責(zé)將MCs 或降解中間產(chǎn)物跨膜運(yùn)輸至細(xì)菌細(xì)胞體內(nèi)[7]。

作為MCs 細(xì)菌降解過程中關(guān)鍵蛋白酶，MlrA 在水生態(tài)系統(tǒng)的修復(fù)過程中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。Dziga 等[8]通過基因克隆在大腸桿菌中過表達(dá)MlrA，將其固定在藻酸鹽珠粒中用作全細(xì)胞生物催化劑，可在短期內(nèi)(3 d)穩(wěn)定去除連續(xù)流湖水培養(yǎng)基質(zhì)中的MC-LR。Dexter 等[9]在藍(lán)藻光合自養(yǎng)宿主中異源表達(dá)MlrA，使其在半自然條件下催化穩(wěn)定性大幅度提高，成功實(shí)現(xiàn)MCs 水污染的原位修復(fù)。然而，目前尚未闡明MlrA 的結(jié)構(gòu)特征與催化機(jī)理，導(dǎo)致無法通過分子修飾或定向進(jìn)化等技術(shù)使酶滿足工業(yè)生產(chǎn)的實(shí)際要求(如催化活力、熱穩(wěn)定性、環(huán)境耐受性等)[10-12]。因此，本研究的主要目標(biāo)為：(1)基于蛋白質(zhì)同源關(guān)系，采用分子模擬構(gòu)建MlrA 結(jié)構(gòu)模型；(2)將MlrA 與底物進(jìn)行對接，分析其結(jié)合模式與相互作用；(3)采用定點(diǎn)突變驗(yàn)證假定活性位點(diǎn)的必要性；(4)研究酶活性的影響因素，明確其催化機(jī)理。

圖1 MCs的結(jié)構(gòu)通式Fig.1 The general structure of microcystins

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌BL21(DE3)，質(zhì)粒pET-30a(+)，MCs 降解 菌Sphingopyxis sp. USTB-05 及mlrA 重 組 菌(GenBank:HM245411.1)均由本實(shí)驗(yàn)室保存[13]。

微囊藻毒素MC-RR(分子式C49H75N13O12, 分子量1038.2,95%)標(biāo)準(zhǔn)品購自臺(tái)灣Algal Science 公司；乙腈(99.9%)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG,99%)、酶抑制劑(EDTA、1, 7-菲咯啉和1, 10-菲咯啉,99%)購自Sigma Aldrich 公司。其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 模型構(gòu)建

從NCBI 數(shù)據(jù)庫檢索Sphingopyxis sp. USTB-05菌的MlrA 序列(GenBank: ADK25053, FASTA 格式)，使用ProtScale 工具分析氨基酸親疏水性，采用PSIBLAST 在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(PDB)中進(jìn)行同源性分析。由于MlrA 與已解析結(jié)構(gòu)蛋白的序列相似性較低(20%～30%)，采用折疊識(shí)別法(fold recognition)進(jìn)行分子模擬。首先通過Threading 程序(HHpred[13]、pGenTHREADER[14]、 Phyre2[15]、 SPARKS-X[16]和CEthreader[17])將MlrA 氨基酸序列提交至蛋白質(zhì)折疊文庫，篩選可用結(jié)構(gòu)模板并生成序列-結(jié)構(gòu)比對信息；隨后提取所預(yù)測二級(jí)結(jié)構(gòu)與模板蛋白進(jìn)行比對；接著將對齊序列輸入建模軟件MODELLER 9.14，計(jì)算生成100 個(gè)原始模型并使用Loop refining模塊對Loop 區(qū)域進(jìn)行循環(huán)優(yōu)化；最后選擇具有最低DOPE得分和最高GA341得分的模型[18]。

基于TM-align 程序[19]計(jì)算的Cα-RMSD(均方根偏差)和TM-score 分布，從不同類模型中選擇最佳模型，使用Deepview 在GROMOS96 43B1 力場中實(shí)施最速下降法進(jìn)行能量最小化，使用PROCHECK[20]、ProSA-web[21]和ERRAT[22]分析蛋白骨架構(gòu)型的幾何質(zhì)量、結(jié)構(gòu)能量分布和殘基相互作用。

1.3 分子對接

分子對接是通過計(jì)算模擬對兩個(gè)或多個(gè)分子進(jìn)行相互識(shí)別，使其滿足幾何匹配與能量匹配的過程。EDTA 三維分子結(jié)構(gòu)取自NikA酶配體(PDB ID：1ZLQ)；MC-LR 三維分子結(jié)構(gòu)由ChemBioDraw 構(gòu)建，使用UCSF Chimera 對其能量最小化，參數(shù)設(shè)置為：1000步的最速下降步驟和1000步的共軛梯度步驟，步長均為0.02 ?(1 ?=0.1 nm)。使用格點(diǎn)對接程序AutoDock 進(jìn)行分子對接，其格點(diǎn)上為受體與探針原子間的相互作用能[23]。根據(jù)MlrA 活性口袋提取潛在催化位點(diǎn)（E172）的坐標(biāo)，網(wǎng)格框參數(shù)設(shè)置如下：對接中心X = -105.85，Y = -8.85，Z = -88.05；盒子尺寸X = 60，Y = 60，Z = 60；格點(diǎn)之間的距離為0.375 ?。選擇Lamarckian 遺傳算法優(yōu)化結(jié)合相互作用，共計(jì)算100 個(gè)結(jié)合構(gòu)象。通過評(píng)估每種構(gòu)象的結(jié)合自由能(ΔGbinding)與復(fù)合構(gòu)象出現(xiàn)的頻次及其合理性選擇最佳結(jié)果在PyMOL和LigPlus中分析。

1.4 定點(diǎn)突變

全基因合成MlrA 突變體的DNA 序列并引入酶切位點(diǎn)，堿基替代結(jié)果見表1。使用Nde I和Not I酶切片段，將目的基因插入pET-30a(+)載體。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli BL21(DE3)后涂覆于Luria-Bertani(LB)平板(含50 μg/ml 卡那霉素)，挑取陽性克隆子并通過基因測序確認(rèn)無誤后進(jìn)行下一步處理。

表1 MlrA點(diǎn)突變體的氨基酸殘基及相應(yīng)替代密碼子Table 1 Amino acid residues and respective codons exchanged in MlrA mutant studies

1.5 MlrA的表達(dá)與提取

Sphingopyxis sp. USTB-05 與mlrA 重組菌按文獻(xiàn)[24]方法培養(yǎng)。MlrA 突變菌培養(yǎng)方法如下：向含50 μg/ml 卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中加入1%新鮮菌液，于37℃、200 r/min 轉(zhuǎn)速下振蕩培養(yǎng)至菌液OD600值達(dá)到0.6～0.8，加入終濃度為0.3 mmol/L 的IPTG 后降溫至30℃誘導(dǎo)6 h。之后，將培養(yǎng)菌液離心(12000 r/min,20 min,4℃)收集，用PBS 緩沖液(pH=7.4)洗滌3 次。最后，將菌體用PBS 緩沖液重懸，于冰水浴中超聲破菌，設(shè)定功率240 W，超聲3 s間歇5 s，全程時(shí)間8 min，分3 次進(jìn)行，以防止溫度升高使酶變性失活。將破碎后的細(xì)胞再次離心，上清液含細(xì)菌全部可溶性蛋白。

1.6 in vitro酶活性分析

取定量酶液置于PBS緩沖液中，如有需要，分別與金屬離子(Cu2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+和Mg2+)或酶抑制劑孵育2 h，然后加入終濃度為10 mg/L MC-RR。制劑渦旋混勻后25℃反應(yīng)60 min，加入10 μl 1% TFA 將酶滅活，經(jīng)高速離心(12000 r/min, 10 min)后取上清液進(jìn)行HPLC 分析。所有樣品一式三份，計(jì)算樣本的標(biāo)準(zhǔn)差(STDEV)反映結(jié)果相對于平均值的離散程度。

使用Agilent 1260型高效液相色譜儀和TC-C18反相色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)進(jìn)行色譜分析。分析測定條件：流動(dòng)相為含有0.05% (體積) TFA 的水(A)和乙腈(B)=65∶35(體積)，流速1.0 ml/min；進(jìn)樣量20 μl；紫外檢測波長239 nm；柱溫箱溫度35℃。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1 MlrA分子模型構(gòu)建

2.1.1 模板篩選 MlrA 由336 個(gè)殘基組成，包含26個(gè)氨基酸編碼的N 端信號(hào)肽[5-6,25]，其序列下游為鑒別于CPBP 家族(CAAX proteases and bacteriocinprocessing enzymes,CAAX 蛋白酶和細(xì)菌素加工酶，其中C 是半胱氨酸，A 是脂肪族氨基酸，X 是任意氨基酸)的ABI(abortive infection)結(jié)構(gòu)域[26]。結(jié)構(gòu)模板初步篩選顯示，PDB 數(shù)據(jù)庫中缺少與MlrA 高度同源(≥30%) 的 蛋 白 質(zhì) 晶 體 結(jié) 構(gòu)，Methanococcus maripaludis 菌 Ras 轉(zhuǎn) 化 酶 1(Ras and a-factor converting enzyme 1,Rce1)是唯一具有遠(yuǎn)程同源性的已解析蛋白(PDB ID: 4CAD)[27]，序列同一性約為20%。Rce1 為定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的整合膜蛋白，介導(dǎo)CAAX蛋白羧基末端-AAX三肽的裂解，在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中具有重要作用[26-28]。由于具有多次跨膜結(jié)構(gòu)，Rce1 直系同源物序列同一性(9%～63%)和分子大小(30×103～37×103)差異較大；但研究表明，任何類型同源物之間跨膜區(qū)段疏水性氨基酸存在差異是普遍現(xiàn)象[28]。因此，盡管Rce1 同源物相似性較低，但具有同樣的催化結(jié)構(gòu)。例如，MlrA和MmRce1都含有保守的ABI 結(jié)構(gòu)域?？紤]到兩類蛋白同屬CPBP 家族且具有膜相關(guān)性，MmRce1 為潛在可用結(jié)構(gòu)模板。

通過比較MmRce1 與MlrA 的二級(jí)結(jié)構(gòu)評(píng)估序列-結(jié)構(gòu)比對的可靠性。根據(jù)圖2 所示，MlrA 與模板結(jié)構(gòu)高度一致，10 個(gè)α-螺旋與催化位點(diǎn)（紅色標(biāo)注氨基酸）的位置基本對齊。同時(shí)，比對信息還顯示了部分差異：MlrA 在對齊結(jié)構(gòu)中存在2 段缺口片段(Trp129-Ala136 和Thr271-Thr277)，無 規(guī) 則 卷 曲的氨基酸形成了特殊環(huán)區(qū)(Loop 1,2)。上述差異將在模型分析部分中進(jìn)行討論。

2.1.2 模型建立與優(yōu)化 通常，將序列同一性低于30%的目的蛋白稱為過渡區(qū)(twilight zone)蛋白[29]。由于此類蛋白與模板蛋白之間的同源性較低，其結(jié)構(gòu)預(yù)測是計(jì)算結(jié)構(gòu)生物學(xué)的難點(diǎn)。Schoonman 等[30]研究表明，折疊識(shí)別法可在低同源性的情況下建立較為準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)模型。該方法不僅考慮了目的蛋白與模板之間的序列相似性，還以模板中的結(jié)構(gòu)信息為基礎(chǔ)，用以獲取相似的折疊方式或結(jié)構(gòu)基序[29]?；诖耍疚氖褂? 種不同算法的Threading 程序分析了MlrA 與MmRce1 的最佳序列-結(jié)構(gòu)比對，然后將各程序給出的比對結(jié)果提交至MODELLER，在空間約束下計(jì)算包含所有非氫原子的模型。最后，對模型的Loop 區(qū)進(jìn)行循環(huán)優(yōu)化，挑擇滿足最佳目標(biāo)函數(shù)的模型并將其提交至TM-align 程序，根據(jù)TMscore 評(píng)估結(jié)構(gòu)比對質(zhì)量。初始模型的評(píng)估結(jié)果見表2。

根據(jù)表2 可知，由pGenTHREADER 構(gòu)建的模型質(zhì)量最佳，與原晶體結(jié)構(gòu)的Cα-RMSD 值為0.68 ?，TM-score 為0.93，且對齊長度略長于其余模型。因此，選擇該模型作為MlrA 最佳模型。為避免模型中存在不良分子接觸，在GROMOS96 43B1 力場中實(shí)施最速下降法進(jìn)行能量最小化。使用多個(gè)模型評(píng)估服務(wù)器驗(yàn)證優(yōu)化模型的質(zhì)量，結(jié)果見圖3。PROCHECK 用于測量模型中逐個(gè)殘基的立體化學(xué)質(zhì)量。由圖3(a)的Ramachandran 圖發(fā)現(xiàn)，MlrA 中92.1%的殘基位于有利區(qū)域(黑色)，7.5%的殘基位于允許區(qū)域(深灰色和淺灰色)，僅有Val278 位于異常區(qū)域(白色)。由于該殘基遠(yuǎn)離蛋白結(jié)合位點(diǎn)，其影響可忽略不計(jì)。使用ProSA-web 計(jì)算MlrA 模型結(jié)構(gòu)的整體質(zhì)量，其Z評(píng)分為-3.19，見圖3(b)。對于相似大小的天然蛋白質(zhì)，該分值表明模型質(zhì)量在可靠范圍內(nèi)。使用ERRAT 程序檢驗(yàn)了模型中非鍵原子相互作用的統(tǒng)計(jì)信息。如圖3(c)所示，MlrA 模型的ERRAT 得分為89.30，表明骨架構(gòu)象和非鍵相互作用合理(＞50)。

圖2 MlrA和MmRce1的二級(jí)結(jié)構(gòu)比對Fig.2 The alignment between MlrA and MmRce1 in secondary structure and residue levels

表2 不同Threading程序?qū)R結(jié)果模型的評(píng)估分析Table 2 Evaluation analysis of the models form the alignment results from the different Threading programs

2.1.3 模型分析 MlrA 主要由8 個(gè)保守跨膜螺旋(TM1～8)組成，螺旋之間由Loop 和膜外螺旋(αA 和αB)連接，見圖4。MlrA 定位于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜，使用MEMSAT-SVM 預(yù)測其N 末端和C 末端指向細(xì)胞質(zhì)。與MmRce1 相比，MlrA 分子表面兩個(gè)不同位置由較長的Loop 組成，在圖4(a)中用黑色箭頭指出。表面環(huán)區(qū)Loop 1 (Trp129-Ala136)增加了二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的運(yùn)動(dòng)幅度，可能影響酶的穩(wěn)定性[31]。而Loop 2(Thr271-Thr277)位于活性位點(diǎn)的U 形入口處，可能通過相互作用形成活性結(jié)構(gòu)有助于底物催化[32]。約100 個(gè)殘基組成的ABI 域?qū)?yīng)于TM4～7，見圖4(b)。4 個(gè)TM 螺旋交錯(cuò)形成反平行螺旋束，被TM1～3 和TM8 螺旋包圍，使內(nèi)部形成體積較大的錐形催化空腔，且腔體一側(cè)通過TM2 和TM4 之間的間隙向外敞開。上述構(gòu)型允許溶劑與底物從空腔底部的周質(zhì)空間進(jìn)入酶分子內(nèi)部，與活性位點(diǎn)進(jìn)行相互作用[27]。

MlrA 的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)與氨基酸親疏水性見圖4(c)。與真核生物類似，細(xì)菌所表達(dá)的膜蛋白同樣依靠信號(hào)肽系統(tǒng)進(jìn)行定位跨膜。MlrA 在細(xì)菌胞質(zhì)內(nèi)合成時(shí)，其N 端疏水且?guī)д姷男盘?hào)肽形成α-螺旋插入磷脂雙分子層中；隨后，具有反平行結(jié)構(gòu)的跨膜螺旋TM1 固定在質(zhì)膜上，使后續(xù)肽鏈準(zhǔn)確跨膜。另一方面，通過親水性指數(shù)(數(shù)值越低則親水性越強(qiáng))可判斷出MlrA 的跨膜區(qū)段具有強(qiáng)疏水性，這可能是其在各類載體(pGEX-4T1[9,13]，pGEX-5T[9]，pET-21a[25]，Synechocystis PCC 6803[9])中表達(dá)為不溶性包涵體的主要原因。此外，疏水性多肽會(huì)抑制核糖體翻譯過程，甚至破壞宿主菌的原有細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)影響菌體生長過程。如Dexter等[9]和Dziga等[25]發(fā)現(xiàn)MlrA異源表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞生長速率大幅降低。

圖3 MlrA分子模型質(zhì)量檢驗(yàn)結(jié)果Fig.3 Validation results for the MlrA model

通過結(jié)構(gòu)疊加分析了催化位點(diǎn)的保守性。由圖4(d)可知，MlrA 假定催化殘基及水分子(W)的位置與MmRce1 活性位點(diǎn)呈良好重疊。圖4(e)顯示了活性位點(diǎn)的位置信息。E172、E173、H205、H260 和N264 均將其側(cè)鏈投射至腔體內(nèi)部，且原子間距在2.9～3.5 nm 之間，可形成氫鍵直接參與底物的催化反應(yīng)。R177 位于催化腔頂部，可與E173 相互作用以阻止底物進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)；而W176和W201的疏水基團(tuán)埋藏在分子內(nèi)部，表明上述殘基不直接參與底物催化[27]。

2.2 MlrA底物水解機(jī)制

為了解MlrA 底物識(shí)別機(jī)制，以該酶的錐形催化空腔為活性口袋，研究了與MC-LR 的對接模式。MC-LR 單體的球棍模型如圖5(a)所示，根據(jù)對接過程中所獲的結(jié)合分?jǐn)?shù)(ΔGbinding= -5.42 kcal/mol,1cal=4.18 J)與合理性選擇最佳構(gòu)象，見圖5(b)。MC-LR通過化學(xué)鍵扭轉(zhuǎn)采用β-發(fā)夾構(gòu)型（β-hairpin structure）進(jìn)入MlrA 催化腔，以降低底物基態(tài)與過渡態(tài)之間的能差。除Adda 側(cè)鏈外，MC-LR 剩余基團(tuán)將非極性氨基酸修飾的TM2 和TM4 之間的空間填充，從而使可斷裂鍵Adda-Arg 暴露于活化水分子（W）與E172和H205附近。

圖5(c)為MlrA 與MC-LR 之間的相互作用。位于相反TM螺旋的E172和H205彼此相對，橋連水分子構(gòu)成谷氨酸(酸)—組氨酸(堿)—水分子(親核)催化三聯(lián)體。酸—堿—親核三聯(lián)體是共價(jià)催化過程中的常見基序，催化殘基通過氫鍵作用建立電荷中繼網(wǎng)絡(luò)，以極化并激活親核試劑攻擊底物形成共價(jià)中間體，然后將其水解以釋放產(chǎn)物并再生游離酶[27-28,33]。據(jù)此，提出MlrA 對MC-LR 的水解機(jī)理如圖5(d)。即E172(酸)對齊并極化H205(堿)，通過堿催化作用將水分子(親核試劑)脫去質(zhì)子激活，降低pKa對Adda-Arg 肽鍵進(jìn)行親核攻擊并產(chǎn)生含氧陰離子中間體。H260 和N264 位于TM7 的連續(xù)螺旋轉(zhuǎn)角，與催化二元組E172 和H205 相對應(yīng)，通過氫鍵形成氧陰離子穴(oxyanion hole)使電荷在過渡態(tài)氧陰離子上聚集，以穩(wěn)定產(chǎn)生的四面體中間體。中間體形成時(shí)Adda-Arg 肽鍵中的氮變?yōu)閴A性，將H205 或E172質(zhì)子轉(zhuǎn)移至胺離去基團(tuán)，迫使氧陰離子發(fā)生崩解產(chǎn)生?；?酶中間體，使MC-LR 裂解為線性。此外，兩個(gè)保守的芳香族殘基(W176 和W201)與E172的側(cè)鏈相接觸，可能會(huì)提高谷氨酸的pKa，加速底物水解速率。

圖4 MlrA分子模型的整體結(jié)構(gòu)Fig.4 The overall structure of the MlrA model

2.3 定點(diǎn)突變

通過質(zhì)粒定點(diǎn)突變，將假定催化殘基替換為丙氨酸(A)驗(yàn)證了其催化必要性。由圖6 可知，MlrA 活性依賴于E172、H205、H260、N264 和E265，其突變體導(dǎo)致酶活性完全喪失。催化三聯(lián)體E172、H205和H260 的 重 要 性 已 在Rce1p[34]，yRce1p[35]和MmRce1[27]中得到證實(shí)。類似于MmRce1，用Ala 取代N264 同樣消除了酶活性，這表明N264 的去質(zhì)子化作用可以使MlrA 失活，其羥基基團(tuán)在催化過程中具有重要作用。另一方面，盡管E265 并未識(shí)別為MlrA 的活性位點(diǎn)，但其突變體對MC-RR 亦無降解活性，類似發(fā)現(xiàn)已在Dziga 等[25]研究中描述。由于谷氨酸具有負(fù)電性，推測E265可能作為質(zhì)子供體將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到反應(yīng)的過渡態(tài)中間物，從而進(jìn)一步穩(wěn)定過渡態(tài)氧陰離子，使反應(yīng)活化能降低并促進(jìn)底物催化。

圖5 MlrA與MC-LR的識(shí)別過程與催化機(jī)理(虛線表示氫鍵)Fig.5 Mode of action and catalytic mechanism of MlrA for MC-LR(dashed bonds represent the hydrogen bond)

圖6 MlrA與點(diǎn)突變體對MC-RR的催化活性Fig.6 Biodegradation activity of MlrA and point mutants for MC-RR

此外，E173A，R177A，H263A 或W201A 突變體會(huì)使MlrA 活性顯著下降，這些殘基位于功能基序附近，其側(cè)鏈基團(tuán)可能通過復(fù)雜相互作用與催化殘基相接觸，從而影響催化反應(yīng)pKa。

2.4 MlrA活性影響機(jī)制

研究發(fā)現(xiàn)[7,25]，金屬螯合劑1, 10-菲咯啉和EDTA 可抑制MlrA 活性，且Bourne 等[6]提出其序列中含有假定的變體鋅結(jié)合基序“HAIHNE(HEXXH)”。因此，MlrA 被推定為金屬蛋白酶。然而，本研究通過分子結(jié)構(gòu)模擬發(fā)現(xiàn)該酶不與Zn2+結(jié)合，因而底物水解機(jī)制不涉及金屬基。此外，將MlrA 與金屬離子共同孵育后評(píng)估了其剩余相對酶活，結(jié)果見圖7，過量Zn2+和Cu2+使酶活性被完全抑制，F(xiàn)e2+、Mg2+和Ca2+也不同程度降低催化效果，這初步表明金屬離子(Ⅱ)無法與MlrA形成有效配位鍵使其活性提高。

為分析金屬酶抑制劑對MlrA 失活原因，使用不螯合Zn2+的1, 7-菲咯啉(1, 10-菲咯啉的立體異構(gòu)體)進(jìn)行了酶活性分析。由圖7 可知，兩類化合物對酶的失活效果相似，濃度愈高抑制作用愈強(qiáng)，且在1 mmol/L 1,10-菲咯啉孵育后加入適量Zn2+無法恢復(fù)其催化活性(數(shù)據(jù)未顯示)。顯然，MlrA 活性與菲咯啉濃度相關(guān)，而不是Zn2+依賴性結(jié)果。Manolaridis等[27]和Dolence 等[35]研究表明，高濃度菲咯啉將引起MmRce1 和yRce1p 發(fā)生非特異性蛋白質(zhì)解折疊現(xiàn)象，導(dǎo)致酶活力降低或喪失。由于MlrA 與Rce1 蛋白具有同源結(jié)構(gòu)，其菲咯啉濃度依賴性失活機(jī)制相似。

圖7 金屬離子和螯合因子對MlrA活性的影響Fig.7 Effects of metal ions and chelating factors on the activity of MlrA

另一方面，盡管MlrA 活性受EDTA 抑制，但作用機(jī)制可能不是結(jié)合酶分子中的金屬離子。例如EDTA 通過競爭底物結(jié)合位點(diǎn)使人肝精氨酸酶[36]和TaqDNA 聚合酶[37]等非金屬酶活性降低。圖8 為EDTA 與MlrA 的結(jié)合方式(ΔGbinding= -3.47 kcal/mol)與相互作用，EDTA 結(jié)合在HAIHNE 基序附近，并與MC-LR 具有相似作用方式。LigPlot 分析表明，EDTA 羧基側(cè)鏈與酶活性位點(diǎn)H205、N264 和S215、H263、R284 具有氫鍵結(jié)合作用；底物結(jié)合位點(diǎn)W201與G234、F235、G238與EDTA有疏水接觸。綜上，EDTA 主要通過競爭MlrA 活性位點(diǎn)降低其對MCs的催化效率。

3 結(jié) 論

(1) MlrA 是定位于細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)膜的整合膜蛋白，其分子結(jié)構(gòu)中不含結(jié)合Zn2+，由ABI 結(jié)構(gòu)域(TM4～7)通過反平行螺旋束形成向周質(zhì)空間開放的催化空腔，使溶劑與底物可進(jìn)入活性位點(diǎn)。

(2) MlrA 的 關(guān) 鍵 催 化 殘 基 包 括E172、H205、H260 和N264。對MC-LR 水解機(jī)制主要為E172 和H205 橋接水分子形成酸(谷氨酸)—堿(組氨酸)—親核(水分子)催化三聯(lián)體，通過堿催化作用將水分子去質(zhì)子化激活，以降低親核殘基的pKa對Adda-Arg肽鍵進(jìn)行攻擊。其次，H260 和N264 形成氧陰離子穴，提供氫鍵穩(wěn)定所產(chǎn)生的四面體氧陰離子中間體。最后，H205 或E172 催化Adda-Arg 肽鍵中的胺離去基團(tuán)發(fā)生質(zhì)子化，使氧陰離子中間體崩解并將MC-LR裂解。

(3)MlrA 為非金屬酶，不與金屬離子(Ⅱ)配位結(jié)合，菲咯啉類化合物將導(dǎo)致酶分子發(fā)生非特異性解折疊而失活，EDTA 通過競爭酶活性位點(diǎn)降低催化效率。

圖8 MlrA與EDTA的相互作用Fig.8 The interaction networks between MlrA-EDTA complexes obtained by docking