熒光染色法和KOH濕片法在不同類型足癬診斷中的應(yīng)用比較

闕冬梅，梁國(guó)雄，楊娟，唐渝璐

中山陳星海醫(yī)院皮膚科，廣東 中山 528415

淺部真菌病是皮膚病中的常見病、多發(fā)病，其中足癬最為常見，尤其是在溫暖潮濕的南方地區(qū),春夏季節(jié)發(fā)病率非常高，因此需要一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。KOH濕片法真菌鏡檢是既往最常用且有效的方法，但步驟相對(duì)繁瑣，制片時(shí)間偏長(zhǎng)，背景雜亂，真菌結(jié)構(gòu)不易分辨和判斷，易出現(xiàn)假陰性或漏診。近年來(lái)熒光染色法真菌鏡檢得到越來(lái)越多的應(yīng)用，本研究比較熒光染色法和KOH濕片法在不同類型足癬中的檢出率和閱片時(shí)間，以供臨床參考。

1 對(duì)象與方法

1.1 病例選擇

收集我院皮膚科門診2018年8月至2020年7月擬診為足癬病例300例，其中118例擬診為水皰鱗屑型足癬，104例擬診為角化過(guò)度型足癬，78例擬診為浸漬糜爛型足癬。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理審查，實(shí)驗(yàn)前患者均簽署知情同意書。

1.2 設(shè)備與試劑

奧林巴斯CX23顯微鏡(增加熒光模塊，日本奧林巴斯公司)；皮膚真菌檢測(cè)系統(tǒng)(2016年版)。10%KOH溶液(實(shí)驗(yàn)室自配)；真菌熒光染色液(Baso,珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。

1.3 方法

每個(gè)病例取材標(biāo)本分成2份，分別采用熒光染色法和KOH濕片法真菌鏡檢。步驟如下：①取材：75%酒精消毒患處后，用鈍刀刮取鱗屑或者皰液或者浸漬的表皮。皮損選取原則：水皰鱗屑型足癬選取鱗屑和皰液，角化過(guò)度型足癬刮除表面鱗屑后選擇底部的鱗屑，浸漬糜爛型足癬刮除白色浸漬表皮，再采集皮損的邊緣。②檢測(cè)：KOH濕片法：加1滴10%KOH，覆蓋玻片，酒精燈微加熱，輕壓蓋玻片，用濾紙吸去周圍溢液，置于光學(xué)顯微鏡下觀察；熒光染色法：加1滴熒光染色液，停留10 s后覆蓋玻片，輕壓后用濾紙吸去溢出染色液，置于熒光顯微鏡下觀察。③分別統(tǒng)計(jì)不同類型足癬使用兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性和陰性例數(shù)，以及各自閱片時(shí)間(只統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性病例)。

1.4 陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)

由兩個(gè)檢測(cè)員進(jìn)行讀片，兩人均看到菌絲或者孢子時(shí)判斷陽(yáng)性。當(dāng)出現(xiàn)同一份標(biāo)本判讀結(jié)果不一致時(shí)，由第三位檢測(cè)員進(jìn)行判定。判斷陰性的標(biāo)本需要閱讀整個(gè)玻片。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩種方法陽(yáng)性率比較采用配對(duì)設(shè)計(jì)卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，閱片時(shí)間的比較采用配對(duì)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熒光染色法與KOH濕片法直接鏡檢鏡下結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

熒光染色法鏡下菌絲及孢子發(fā)出亮藍(lán)色的熒光,與周圍的淡藍(lán)色背景形成鮮明對(duì)比，菌絲及孢子結(jié)構(gòu)清晰可見，與周圍角質(zhì)細(xì)胞容易區(qū)分。部分臨床病例真菌形態(tài)清晰可見，似培養(yǎng)狀態(tài)下的菌絲結(jié)構(gòu)，可初步根據(jù)形態(tài)特征對(duì)致病菌種進(jìn)行提示性診斷(圖1A)。即使極少量菌絲的情況下也能明確區(qū)分，斷裂的菌絲片段分隔清晰可見，容易與污染雜質(zhì)區(qū)分(圖1B)。熒光染色下植物纖維素也會(huì)被熒光標(biāo)記，但大小形態(tài)不同，形態(tài)不規(guī)則，邊緣銳利，無(wú)菌絲和橫隔，與片段化的菌絲可明確區(qū)別(圖1C)。

圖1 熒光染色法真菌鏡檢(400×) 1A:菌絲及孢子結(jié)構(gòu)清晰可見，部分情況下呈現(xiàn)培養(yǎng)狀態(tài)下的菌絲形態(tài);1B:斷裂的菌絲片段，結(jié)構(gòu)清晰，可見典型分隔;1C:被熒光標(biāo)記的植物纖維素，形態(tài)不規(guī)則且沒(méi)有分隔

KOH濕片法鏡下背景雜亂，菌絲及孢子與脂滴、氣泡、雜質(zhì)等不易分辨(圖2)。

圖2 KOH濕片法真菌鏡檢(400×):菌絲及孢子結(jié)構(gòu)不清晰，容易與周圍雜質(zhì)混淆Fig.2 Under microscopy with KOH wet-mount (400×), unclear hyphae and spore structure, non-differentiable from surrounding impurities.

2.2 不同類型足癬使用兩種檢測(cè)方法的陽(yáng)性率比較

在水皰鱗屑型、角化過(guò)度型、浸漬糜爛型三種不同類型的足癬中,熒光染色法檢測(cè)陽(yáng)性率分別為91.53%(108/118)、75.96%(79/104)、98.72%(77/78);KOH濕片法陽(yáng)性率分別為80.51%(95/108)、47.12%(49/104)、97.44%(76/78)。兩種方法陽(yáng)性率在水皰鱗屑型和角化過(guò)度型足癬中差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(2值分別為5.33、20.45，P值均<0.05)，而在浸漬糜爛型足癬中無(wú)明顯差異(2=7.93，P=0.062)，詳見表1。

表1 熒光染色法和KOH濕片法真菌鏡檢陽(yáng)性率比較Tab.1 Comparison of the positive rates of various specimens under direct microscopy between fluorescent staining and KOH

2.3 不同類型足癬使用兩種檢測(cè)方法的閱片時(shí)間比較

熒光染色法與KOH濕片法檢測(cè)水皰鱗屑型足癬閱片時(shí)間分別為(65.23±10.60) s、(90.75±12.15) s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=13.51，P<0.05);檢測(cè)角化過(guò)度型足癬閱片時(shí)間分別為(90.52±13.23) s、(150.35±15.16) s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.60，P<0.05);檢測(cè)水皰鱗屑型足癬閱片時(shí)間分別為(38.13±8.62) s、(48.28±16.20) s，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.35，P<0.05)。

3 討論

足癬由于傳染性強(qiáng)，通過(guò)共用鞋襪即可發(fā)生感染，人群發(fā)病率高。根據(jù)臨床表現(xiàn)通常分為3種類型，即水皰鱗屑型、角化過(guò)度型及浸漬糜爛型[1]。癥狀通常輕微，除瘙癢以外可無(wú)任何不適，患者重視度不夠，常不治療或者是自行隨意購(gòu)買外用藥治療，以上情況可導(dǎo)致足癬類型發(fā)生改變或?qū)е码y以辨認(rèn)足癬的出現(xiàn)。

KOH濕片法是臨床上直接鏡檢使用最早、最廣的方法，該法操作簡(jiǎn)單、快捷、不需要特殊儀器。但KOH濕片法對(duì)真菌無(wú)染色強(qiáng)化作用，背景雜亂，需要操作者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判讀，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)假陰性或者假陽(yáng)性的情況。熒光染色技術(shù)使用特殊的熒光染料，可以特異性結(jié)合真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)和葡聚糖，在熒光顯微鏡下熒光標(biāo)記的真菌易于觀察，形態(tài)清晰，提高了真菌鏡檢的敏感性?；阽R下形態(tài)特征，還可以進(jìn)一步對(duì)致病真菌菌種進(jìn)行提示性診斷，更具有臨床價(jià)值[2]。免疫熒光法容易掌握，操作與KOH濕片法一致，且一步到位，無(wú)需加熱和等待時(shí)間，耗時(shí)短，結(jié)果更直觀。既往研究表明熒光染色法在特殊標(biāo)本如菌量少、毛發(fā)、甲屑或者經(jīng)治標(biāo)本等檢測(cè)中陽(yáng)性率更高，在頭癬和甲癬的診斷中更有優(yōu)勢(shì)[3-5]。

本研究比較熒光染色法和KOH濕片法檢測(cè)收集到的不同類型足癬發(fā)現(xiàn)，水皰鱗屑型足癬和角化過(guò)度型足癬熒光染色法陽(yáng)性率明顯高于KOH濕片法，尤其是菌絲量少的角化過(guò)度型足癬，研究結(jié)果與既往類似報(bào)道一致[6]。但在浸漬糜爛型足癬中，兩種方法的陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與浸漬糜爛型足癬真菌生長(zhǎng)活躍，真菌量多，不容易漏診和誤診有關(guān)。這與杜鵬等[7]研究的熒光染色法在疑難標(biāo)本如外涂藥膏標(biāo)本、色素減退型花斑癬皮屑、用藥后復(fù)查標(biāo)本，尤其是甲標(biāo)本中的檢查中有明顯優(yōu)勢(shì)的結(jié)論相一致。

在菌量少、菌絲容易出現(xiàn)片段化的角化過(guò)度型足癬中，兩種方法閱片時(shí)間均較長(zhǎng)，但熒光染色法明顯短于KOH濕片法。既往研究[4-5]發(fā)現(xiàn)熒光染色法在其他類型的淺部真菌感染檢測(cè)中也能明顯縮短閱片時(shí)間。本研究顯示閱片時(shí)間在三種類型足癬中熒光染色法均短于KOH濕片法，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

熒光染色法可將菌絲染色，從而與周圍細(xì)胞和雜質(zhì)區(qū)分且真菌結(jié)構(gòu)顯示清晰，但植物纖維素也可以被熒光標(biāo)記，尤其與斷裂的片段化菌絲容易混淆，需要特別注意。本研究清晰地展示了兩者的區(qū)別。既往研究[8]也有類似結(jié)論。

綜上所述，熒光染色法檢測(cè)水皰鱗屑型足癬和角化過(guò)度型足癬真菌感染優(yōu)于KOH濕片法，尤其是在菌量少，出現(xiàn)片段化菌絲的角化過(guò)度型足癬的標(biāo)本中，且耗時(shí)短，值得臨床推廣應(yīng)用。