兩種靶向血栓載尿激酶微泡理化特性的比較研究*

饒華清，車雪瑜，潘曉熊，黃 崗，陳 星，吳 棘△

(1.廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院，南寧 530021；2.廣西科學(xué)院，南寧 530003)

由血栓引起的血栓性疾病是一種常見的心腦血管疾病，溶栓是最為有效的治療方法。尿激酶作為第一代溶栓藥物，由于其療效好、原料豐富、價格便宜，是臨床上最常用的溶栓藥物。尿激酶在體內(nèi)的血液清除半衰期較短，只有20 min左右，溶栓時需要持續(xù)靜脈滴注以維持血藥濃度，容易引起出血的并發(fā)癥，若讓尿激酶具有血栓靶向性，選擇性地作用于血栓部位，那么就可以提高尿激酶局部血藥濃度，減少尿激酶的用量從而減少出血不良反應(yīng)。

精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(Arg-Gly-Asp，RGD)是具有生物活性的短肽序列之一，其能與活化血小板表面的糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體特異性結(jié)合，即可與血栓特異性結(jié)合，是血栓的靶點之一[1]。

聲諾維(SonoVue)是目前臨床上最常用的超聲造影劑，其可作為一個載體將靶點與藥物結(jié)合起來。而脂質(zhì)體(Liposome)是脂類材料分散在水中時形成的脂質(zhì)雙分子層，水溶性和脂溶性藥物可分別包裹在脂質(zhì)體內(nèi)部和雙分子層中，是一種低毒高效的藥物載體[2-3]。

本研究分別制備了載尿激酶攜RGD聲諾維和載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體，探討兩種載體各自的優(yōu)缺點，從中找出最適宜的靶向血栓載體。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

尿激酶原料藥、膽固醇、二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)、DiI染料均購自北京索萊寶科技有限公司，DSPE-mPEG2000、二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000-cRGD(DSPE-mPEG2000-cRGD)購自湖南華騰制藥有限公司，異硫氰熒光素(FITC)標(biāo)記的尿激酶和5-TAMRA熒光標(biāo)記的RGD肽段由上海吉爾生化合成有限公司，聲諾維(注射用六氟化硫微泡)購自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中心藥房，Bradford蛋白濃度測定試劑盒(去垢兼容型)購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司等。

1.2 載尿激酶攜RGD聲諾維的制備

1.2.1制備

使用直接連接法制備載尿激酶攜RGD聲諾維。將聲諾維粉劑與5 mL生理鹽水混合后搖晃30 s后可得到白色、乳狀的微泡混懸液。將FITC標(biāo)記的尿激酶和5-TAMRA標(biāo)記的RGD分別溶于生理鹽水中并混勻。按照一定的比例將三者混勻，用旋渦混合器以400 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩60 s后，室溫下靜置、孵育2 h。

1.2.2洗滌

上述制備完成后，取出一半靜置，另一半采用浮選法洗滌[4]：將混懸液置于離心管內(nèi)，加入等量的生理鹽水，400 r/min離心1 min后可見微泡聚集在液體的頂部，保留上層液，棄去下清液，重復(fù)洗滌2次。

1.2.3理化性質(zhì)檢測

取少量微泡混懸液，光學(xué)顯微鏡下觀察其形態(tài)和大小；熒光顯微鏡觀察微泡的熒光標(biāo)記情況；粒徑細胞儀測定微泡的粒徑。

1.2.4載尿激酶攜RGD聲諾維雙結(jié)合率檢測

流式細胞儀下檢測FITC熒光標(biāo)記尿激酶、5-TAMRA熒光標(biāo)記RGD與聲諾維的雙結(jié)合率，洗滌后再次檢測雙結(jié)合率。

1.3 載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體的制備

采用薄膜水化法制備載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體。按一定比例稱量DPPC、膽固醇、DSPE-mPEG2000、DSPE-mPEG2000-cRGD，將混合物加入茄形瓶中用5 mL氯仿溶解，并用水浴超聲5 min使其完全溶解，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)使其在瓶底形成均勻的薄膜，放在真空干燥機中干燥過夜，以揮發(fā)干凈有機溶劑。次日，用5 mL PBS緩沖液溶解尿激酶，加入茄形瓶中振蕩并結(jié)合水浴超聲將瓶底的薄膜水化，待薄膜完全水化后形成乳白色的混懸液，用移液槍轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)，超聲細胞破碎儀(比利時Diagenode公司)超聲10 min(4 ℃，5 s/5 s，on/off，320 W，60個循環(huán))。超聲完成后，4 ℃ 3 000 r/min離心5 min，離心后立即吸取上清液至EP管內(nèi)。將混懸液轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，用2 L的PBS緩沖液透析6 h以除去未包封的尿激酶。用同樣的方法制備空白對照脂質(zhì)體(脂質(zhì)體內(nèi)包封的是PBS緩沖液)。

1.3.1檢測理化性質(zhì)

取少量制備好的載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體，在光學(xué)顯微鏡及透射電鏡下觀察脂質(zhì)體的形態(tài)及大?。涣郊毎麅x測定脂質(zhì)體的粒徑。

1.3.2載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體的體外釋放曲線

取2 mL制備好的載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體置于透析袋內(nèi)，兩端扎緊放進50 mL的離心管內(nèi)，在離心管內(nèi)加入20 mL pH為7.4的PBS緩沖液作為釋放介質(zhì)，于37 ℃搖床(100 r/min)進行釋放試驗。分別于0.2、0.4、1、2、3、4、5、6、7、8、12、24 h取6 mL透析袋外的液體，同時補充等量的PBS緩沖液。用Bradford蛋白濃度測定試劑盒測定釋放液中尿激酶的濃度。

1.3.3載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體的體外靶向性實驗

配制濃度為10 μmol/L的DiI熒光染料，將載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體或載尿激酶脂質(zhì)體與DiI染料避光孵育20 min，制備成帶熒光的脂質(zhì)體。將新鮮血液滴于載玻片上，干燥使其凝固，取少量孵育好的載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體和單純載尿激酶脂質(zhì)體滴加在血凝塊上，孵育20 min，沖洗后用熒光顯微鏡觀察脂質(zhì)體與血凝塊的結(jié)合情況。

2 結(jié) 果

2.1 載尿激酶攜RGD聲諾維

2.1.1表征

載尿激酶攜RGD聲諾維靶向微泡外觀呈玫紅色，不透明，靜置以后容易分層，上層為白色凝乳狀的微泡，下層為微微渾濁、半透明的玫紅色液體；在光學(xué)顯微鏡下，洗滌前靶向微泡呈圓形，分布均勻，無明顯聚集現(xiàn)象；洗滌后微泡大小未見明顯改變，但可見聚集現(xiàn)象。在熒光顯微鏡下，靶向微泡表面可激出尿激酶和RGD的圓環(huán)形熒光標(biāo)記，熒光染色均勻。連續(xù)洗滌2次后，熒光強度減弱。

2.1.2粒徑大小和雙攜帶率

粒徑大小約5 015.2 nm，聲諾維攜RGD粒徑約4 321.3 nm；載尿激酶攜RGD聲諾維的平均粒徑約4 432.7 nm，見圖1；洗滌前載尿激酶攜RGD聲諾維的雙攜帶率為76.33%，洗滌后雙攜帶率為46.19%，見圖2。

A:聲諾維載尿激酶；B:聲諾維攜RGD；C:載尿激酶攜RGD聲諾維。

A、B:洗滌前；C、D:洗滌后。

2.2 載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體

2.2.1表征

脂質(zhì)體外觀呈乳白色，渾濁、不透明，靜置后也不分層。在光學(xué)顯微鏡下僅能觀察到細小的圓點，其內(nèi)結(jié)構(gòu)顯示不清，透射電鏡下可見脂質(zhì)體呈類圓形(圖3)?？瞻字|(zhì)體平均粒徑約139.7 nm；載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體平均粒徑約141.3 nm，見圖4。

圖3 載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體的透射電鏡形態(tài)

A:空白脂質(zhì)體粒徑；B：載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體粒徑。

2.2.2載藥量包封率和體外釋放

根據(jù)以下公式(1)、(2)計算出脂質(zhì)體的載藥量為19.07%，包封率為34.33%。

(1)

(2)

在體外模擬人體環(huán)境中，隨著時間的延長，尿激酶緩慢釋放，1 h尿激酶釋放率約36.34%，12 h后尿激酶釋放開始進入平臺期，24 h后尿激酶幾乎停止釋放，見圖5。

圖5 載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體的體外釋放曲線

2.2.3體外實驗

在載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體的體外靶向性實驗中，熒光顯微鏡下可見靶向脂質(zhì)體與血凝塊結(jié)合，載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體發(fā)出紅色熒光(圖6)，而單純載尿激酶脂質(zhì)體未能與血凝塊結(jié)合，未見明顯熒光。

圖6 載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體的體外靶向性實驗

3 討 論

近年來，超聲造影劑在應(yīng)用研究方面取得了突破性的進展，其在治療領(lǐng)域的發(fā)展也越來越受到關(guān)注[5]。隨著超聲造影劑的出現(xiàn)和不斷發(fā)展[6]，將特異性配體連接到造影劑微泡的表面，使其到達感興趣的組織或器官[7]，選擇性的與相應(yīng)受體結(jié)合，從而達到特異性增強靶區(qū)的超聲信號或局部靶向治療的目的[8-9]。微泡造影劑攜帶藥物的方法主要有[10]：(1)藥物直接黏附在微泡表面；(2)將藥物摻入微泡內(nèi)部；(3)將藥物嵌入微泡膜上；(4)通過靜電吸附作用，藥物可以非共價結(jié)合到微泡表面。

本實驗通過直接連接法將尿激酶黏附在造影劑聲諾維的微泡外殼上。采用直接連接法時，由于聲諾維微泡的外殼為單層磷脂，而脂質(zhì)微泡具有化學(xué)雙極性(即結(jié)構(gòu)上同時具備疏水與親水兩種基團)，在不添加其他外在化學(xué)成分的情況下可以通過自身的離子鍵、物理吸附等方法將藥物直接黏附到聲諾維壁上，方法簡單，易于操作[5]。在熒光顯微鏡下可見載尿激酶攜RGD聲諾維微泡發(fā)出圓環(huán)狀熒光，表明尿激酶與RGD均位于微泡表面。流式細胞儀結(jié)果表明，靜置2 h后載尿激酶攜RGD聲諾維的雙結(jié)合率未見明顯改變，較為穩(wěn)定；但洗滌后靶向微泡的雙結(jié)合率由76.33%下降至46.91%，結(jié)合率明顯下降。洗滌后結(jié)合率下降的原因可能是尿激酶與聲諾維微泡表面磷脂的結(jié)合力(離子鍵)為非共價結(jié)合不穩(wěn)定。

對于脂質(zhì)體的制備則采用薄膜水化法。由于尿激酶是水溶性藥物，此方法對水溶性藥物可獲得較高的包封率，但是制備出的脂質(zhì)體粒徑較大且不均一，通過超聲波處理在一定程度上可以減小脂質(zhì)體的粒徑并使其均一化[11]。本實驗制備出的負載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體粒徑大小約141.3 nm，屬于納米級別，納米級別的載體可以滲入更小的細胞間隙[12]，使藥物更好地發(fā)揮作用。而載尿激酶RGD修飾脂質(zhì)體的體外靶向性實驗表明制備出來的脂質(zhì)體可在體外與血栓相結(jié)合，具有血栓靶向性。

藥物在血液運輸過程中由于各種酶的作用會有一部分被丟失[13]，這可能是藥物在體內(nèi)有生物半衰期的原因之一，如果單純使用游離藥物，為了使藥物在血液中達到有效的治療濃度，則需要加大藥量，但加大藥量可能會導(dǎo)致全身性的不良反應(yīng)且難以達到靶向的效果。尿激酶在人體內(nèi)的半衰期約為20 min，為了達到溶栓效果，臨床上常常需要持續(xù)靜脈滴注，大大增加了患者的出血風(fēng)險。而將藥物與載體結(jié)合或者包封于載體內(nèi)，在靶向的位置釋放藥物使藥物在局部聚集，這才是較為理想的藥物傳輸方式[8,14]。本實驗將尿激酶直接吸附在聲諾維微泡的表面，并不能減少尿激酶與血液的接觸，即尿激酶在體內(nèi)的半衰期并不能延長，這點與游離尿激酶一致。本實驗制備的載尿激酶攜RGD聲諾維微泡的優(yōu)勢主要在于可以行超聲顯影觀察血栓的位置及大小，攜帶RGD的聲諾維可以靶向血栓使其周圍聚集尿激酶，血栓局部的尿激酶濃度增加；但是該靶向微泡的缺陷也十分明顯，其與尿激酶、RGD雙攜帶率經(jīng)洗滌之后大幅度下降，外加在人體復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境下尿激酶的半衰期短，在同等藥量下，可能游離尿激酶的溶栓效果會更好。有研究表明[15]，納米脂質(zhì)體在提高藥物療效與減少用藥量方面有重要的作用。脂質(zhì)體可以將親水性的尿激酶包封于含水的內(nèi)腔，避免了尿激酶過早的與血液接觸導(dǎo)致衰減，相當(dāng)于延長了尿激酶的半衰期，同時也避免了尿激酶在到達血栓前過早釋放而減少了藥物的用量；在脂質(zhì)體的膜材中加入了靶向血栓的RGD肽段，可以使脂質(zhì)體靶向血栓后緩慢釋放尿激酶溶栓；但本研究制備的脂質(zhì)體包封率和載藥量都不高，在制備過程中會造成尿激酶的浪費。有研究表明，采用其他方法如主動載藥法等制備脂質(zhì)體，其包封率可達到90%以上[16]，可見脂質(zhì)體包載尿激酶的包封率和載藥量還有提升的空間。

綜合考慮，脂質(zhì)體更適于作為靶向血栓的載體，下一步需要研究提高包封率與載藥量的具體方法。脂質(zhì)體主要由磷脂和膽固醇構(gòu)成，其中磷脂是主體成分，而磷脂有天然提取和人工合成兩類，因此制備脂質(zhì)體的磷脂種類繁多。本研究采用的磷脂是DPPC，接下來筆者將研究其他種類的磷脂(如卵磷脂、氫化卵磷脂等)對脂質(zhì)體的包封率和載藥量是否有影響，從中找出脂質(zhì)體包封尿激酶最佳的膜材配方及比例。與此同時，改進脂質(zhì)體的制備方法。脂質(zhì)體的制備方法眾多，除了本研究中的薄膜水化法，還有注入法、逆向蒸發(fā)法、pH梯度法、冷凍干燥法、凍融法、超聲分散法等，在制備載藥脂質(zhì)體的過程中根據(jù)實際情況有選擇地結(jié)合和改變，以期在增加脂質(zhì)體的包封率和載藥量的同時不損害藥物的活性。