伴微乳頭結(jié)構(gòu)肺腺癌中c-Met、VEGF的表達(dá)及意義*

邱 靜，戴曉麗，王 琪，王婷婷，梁曉東

(1.江蘇省鹽城市第三人民醫(yī)院病理科 224000；2.江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院，江蘇鹽城 224000)

肺癌是全球發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤之一，5年生存率僅有14%[1]。近年來，肺腺癌所占比率有明顯增長(zhǎng)趨勢(shì)，目前已成為多數(shù)國(guó)家最常見的肺癌組織學(xué)亞型。肺腺癌又分為眾多亞型，其中，伴微乳頭狀結(jié)構(gòu)肺腺癌(pulmonary adenocarcinoma with a micropapillary pattern,MPPAC)由AMIN等[2]在2002年首次報(bào)道，2011版肺腺癌組織學(xué)分類新標(biāo)準(zhǔn)首次將含有微乳頭結(jié)構(gòu)(micropapillary pattern,MPP)≥5%遞增量的浸潤(rùn)性肺腺癌單獨(dú)劃分為一個(gè)新的組織學(xué)亞型，常與肺癌的其他亞型(如貼壁生長(zhǎng)型、腺泡型、乳頭型、實(shí)體型等)混合存在，純型罕見。與普通型肺腺癌比較，MPPAC整體預(yù)后較差，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[3]。目前，有關(guān)MPPAC潛在分子機(jī)制尚不完全清楚。而肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體c(c-Met)為酪氨酸蛋白激酶家族成員，許多惡性腫瘤都伴有c-Met基因的擴(kuò)增和過度表達(dá)[4]，c-Met信號(hào)通路有可能成為MPPAC的潛在治療靶點(diǎn)。此外，血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作為重要的促血管生成因子[5]，其表達(dá)與MPPAC的關(guān)系也受到關(guān)注。目前國(guó)內(nèi)對(duì)于c-Met、VEGF與MPPAC關(guān)系的研究尚少，本研究對(duì)116例肺腺癌根治標(biāo)本分組進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，比較c-Met、VEGF在MPPAC組及MPP陰性組中的表達(dá)，探討兩者表達(dá)的相關(guān)性，以及其與MPPAC患者臨床病理因素的關(guān)系，分析其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移中的作用，為探尋有效的靶向藥物治療提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年5月至2019年5月在江蘇省鹽城市第三人民醫(yī)院行肺癌手術(shù)切除標(biāo)本116例(排除術(shù)前行放/化療及合并其他腫瘤患者)及50例癌旁正常肺組織，所有標(biāo)本均經(jīng)病理證實(shí)為腺癌，根據(jù)2011年發(fā)表的肺腺癌新分類診斷標(biāo)準(zhǔn)：以MPP是否大于5%將116例肺腺癌病例分為56例MPPAC組和60例MPP陰性組，50例癌旁正常肺組織為對(duì)照組。入選標(biāo)本的組織學(xué)類型、分化程度及分期等均經(jīng)高年資病理醫(yī)師確診。MMPAC組中男32例，女24例；年齡51～79歲，中位年齡66歲；占主要成分的腫瘤組織學(xué)分型，貼壁型2例、腺泡/乳頭型31例、實(shí)體型9例，微乳頭型14例；根據(jù)IASLC第八版國(guó)際肺癌TNM分期，Ⅰ期23例、Ⅱ期19例、Ⅲ期9例、Ⅳ期5例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者27例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例。MPP陰性組中男23例，女37例；年齡28～82歲，中位年齡63歲；占主要成分的腫瘤組織學(xué)分型，貼壁型13例、腺泡/乳頭型36例、實(shí)體型11例；根據(jù)IASLC第八版國(guó)際肺癌TNM分期，Ⅰ期29例、Ⅱ期21例、Ⅲ期7例、Ⅳ期3例；無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者31例，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者29例。

1.2 方法

采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)c-Met及VEGF在各組的表達(dá)。兔抗人c-Met多克隆抗體、兔抗人VEGF單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，SP系列免疫組織化學(xué)檢測(cè)試劑盒及DAB試劑盒均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。石蠟標(biāo)本4 μm切片，脫蠟至水、3% H2O2封閉、高溫高壓法修復(fù)抗原、自然冷卻，滴加封閉用正常山羊血清，30 min后去山羊血清，滴加稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜，次日復(fù)溫，滴加二抗，DAB顯，蘇木素染核，脫水，封片。結(jié)果判定:相應(yīng)部位出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒，c-Met主要表達(dá)于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)；VEGF主要表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：采用半定量積分法[6]。按著色強(qiáng)度：未著色記0分，淺黃色為弱陽(yáng)性記1分；棕黃色為陽(yáng)性記2分；棕褐色為強(qiáng)陽(yáng)性記3分；每張切片選取10個(gè)高倍視野(×400)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分比，陽(yáng)性細(xì)胞所占比例小于或等于5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%為3分；上述兩種評(píng)分相加，≥3分為陽(yáng)性，<3分為陰性。結(jié)果由2名高年資病理醫(yī)師進(jìn)行盲法判讀。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用χ2比較c-Met、VEGF表達(dá)各組組織中的差異。采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析檢驗(yàn)c-Met與VEGF的表達(dá)在56例MPPAC患者中的相關(guān)性。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MPPAC組、MPP陰性組和對(duì)照組肺組織中c-Met、VEGF的表達(dá)

c-Met陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞膜和胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色或棕褐色顆粒，其在各組中的表達(dá)情況見圖1，MPPAC組中c-Met陽(yáng)性表達(dá)率為69.64%(39/56)，明顯高于MPP陰性組51.67%(31/60)和對(duì)照組6.00%(3/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；VEGF表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，為棕黃色或棕褐色顆粒，其在各組中的表達(dá)情況見圖2，MPPAC組中c-Met陽(yáng)性表達(dá)率為66.07%(37/56)，明顯高于MPP陰性組50.00%(30/60)和對(duì)照組8.00%(4/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。

A:MPPAC組；B：MPP陰性組；C：對(duì)照組。

2.2 MPPAC組肺腺癌組織c-Met表達(dá)與VEGF的關(guān)系

本研究中，c-Met與VEGF在MPPAC組中共陽(yáng)性表達(dá)36例，共陰性表達(dá)16例，經(jīng)Spearman等級(jí)相關(guān)分析證明c-Met表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.783，P<0.01)，見表1。

表1 MPP陽(yáng)性組中c-Met與VEGF蛋白表達(dá)的關(guān)系

2.3 MPPAC組肺腺癌組織中c-Met、VEGF表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

MPPAC組患者組織c-Met、VEGF的表達(dá)與腫瘤的分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，而與患者性別、年齡、有無吸煙史、腫瘤大小及組織學(xué)分型無關(guān)(P>0.05)，見表2。c-Met、VEGF在MPPAC組各組織學(xué)分型中的表達(dá)見圖3、4。

表2 MPPAC組c-Met、VEGF的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

續(xù)表2 MPPAC組c-Met、VEGF的表達(dá)與臨床病理因素的關(guān)系

A:貼壁型；B：腺泡/乳頭型；C：實(shí)體型；D：微乳頭型。

A:貼壁型；B：腺泡/乳頭型；C：實(shí)體型；D：微乳頭型。

3 討 論

肺癌是目前全球第一大癌癥，在我國(guó)肺癌的發(fā)病率和病死率居于惡性腫瘤的首位。近年來，肺腺癌發(fā)病率逐年提高。MPP作為惡性腫瘤的一種特殊的病理學(xué)形態(tài)，首先在乳腺癌中被描述，含有MPP的乳腺癌發(fā)現(xiàn)時(shí)臨床分期較晚，預(yù)后較差[7]。MPPAC是一類浸潤(rùn)程度較強(qiáng)、易轉(zhuǎn)移、預(yù)后差的惡性腫瘤。MPPAC可與任何一種肺腺癌組織學(xué)亞型混合存在，至今未發(fā)現(xiàn)單純MPPAC報(bào)道。目前對(duì)于MPPAC的研究較少，其潛在的分子機(jī)制尚不完全明確，尋找以MPPAC為主的肺腺癌發(fā)生發(fā)展和預(yù)后相關(guān)的生物學(xué)標(biāo)志物，檢測(cè)癌基因與抑癌基因產(chǎn)物對(duì)腫瘤的影響，以尋求有效的靶向治療成為近年來研究的熱點(diǎn)。

c-Met基因?yàn)橐环N原癌基因，為肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HGF)的唯一受體，其編碼的蛋白屬于酪氨酸激酶家族成員?；罨罂杉せ疃鄠€(gè)下游信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖、分化、抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤血管生成等[8]。許多腫瘤中都伴有c-Met基因的擴(kuò)增和過表達(dá)，如胃癌、結(jié)腸癌[9-10]等，c-Met陽(yáng)性表達(dá)的癌細(xì)胞更具有侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的能力[11]，且有研究表明肺癌中Met基因擴(kuò)增與分子靶向藥物的耐藥性相關(guān)[12]。

血管生成在腫瘤的生長(zhǎng)、增殖及侵襲轉(zhuǎn)移過程中至關(guān)重要。VEGF是目前發(fā)現(xiàn)的作用最強(qiáng)的促血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖與生成因子之一，可較好地誘導(dǎo)血管新生。它與腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞相應(yīng)受體結(jié)合后，可刺激腫瘤血管內(nèi)皮增生，誘導(dǎo)血管生成，增加血管通透性等，為腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移提供物質(zhì)基礎(chǔ)[5]。研究表明[13]具有MPP結(jié)構(gòu)的腫瘤發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移可能與腫瘤組織中的VEGF表達(dá)明顯升高有關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)，c-Met、VEGF在MPPAC組肺腺癌中的表達(dá)明顯高于MPP陰性組肺腺癌及對(duì)照組肺組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且在TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺腺癌組織中均呈高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示c-Met及VEGF的過表達(dá)與MPPAC的發(fā)生發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)。且結(jié)果顯示c-Met、VEGF表達(dá)與患者的性別、年齡、吸煙史、腫瘤大小及組織學(xué)分型無明顯相關(guān)性。Spearman等級(jí)相關(guān)分析表明，c-Met表達(dá)與VEGF表達(dá)在MPPAC組肺腺癌組織中關(guān)系密切(r=0.783，P<0.01)。且c-Met表達(dá)與VEGF表達(dá)呈正相關(guān)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致[14]，表明在MPPAC中c-Met 與VEGF均對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在協(xié)同作用，兩者共同參與促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、增殖及調(diào)控腫瘤血管生成。研究表明[15]，c-Met活化后可促進(jìn)VEGF的表達(dá)，而VEGF可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂，刺激腫瘤的血管生成，故推測(cè)MPPAC易發(fā)生浸潤(rùn)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后差可能與c-Met和VEGF在促進(jìn)腫瘤血管生成方面的協(xié)同作用有關(guān)。因此，MPPAC患者中c-Met 與VEGF聯(lián)合檢測(cè)對(duì)判斷病情、指導(dǎo)治療、評(píng)價(jià)預(yù)后有一定價(jià)值。

綜上所述，MPPAC中c-Met、VEGF均高表達(dá)，且在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者組織中表達(dá)更高，說明c-Met、VEGF在MPPAC的發(fā)生發(fā)展中可能起重要作用，其高表達(dá)可能增加MPPAC患者侵襲、轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，與患者生存率降低和預(yù)后差相關(guān)。c-Met表達(dá)與VEGF表達(dá)的相關(guān)性說明在MPPAC中c-Met 與VEGF均對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展起協(xié)同作用，c-Met可能通過促進(jìn)VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移、侵襲及血管再生等。提示c-Met、VEGF的測(cè)定可以作為MPPAC發(fā)生發(fā)展的潛在生物標(biāo)志物，對(duì)MPPAC的惡性程度及預(yù)后情況作出更加準(zhǔn)確的判斷，為臨床診斷與治療提供依據(jù)。c-Met、VEGF信號(hào)通路可成為MPPAC治療中很有前途的靶點(diǎn)，抑制c-Met、VEGF的表達(dá)或許能夠延長(zhǎng)MPPAC患者復(fù)發(fā)時(shí)間，提升總體生存期。