miR-125b和miR-335在炎癥性腸病患者外周血和腸黏膜中的表達(dá)研究*

楊文宏,孫惠芳,楊 潔

(河北省秦皇島市第一醫(yī)院：1.內(nèi)科ICU；2.重癥醫(yī)學(xué)一科；3.消化內(nèi)一科 066000)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)是一種慢性病，主要發(fā)生于機(jī)體的胃腸等消化道部位，臨床病理類型主要包括潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩病(Crohn′s disease，CD)。最近數(shù)據(jù)資料顯示，IBD的發(fā)病率在我國(guó)呈上升趨勢(shì)[1-3]，給我國(guó)人民健康造成嚴(yán)重威脅。目前有關(guān)該疾病的病因和發(fā)病機(jī)制仍不清楚。微RNA(microRNA,miRNA)是由20個(gè)左右堿基構(gòu)成的微小RNA分子，可與mRNA 3′端非編碼區(qū)(3′UTR)結(jié)合，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與個(gè)體發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞分化等生命活動(dòng)過(guò)程[4-5]。已有研究表明miR-125b與miR-335可通過(guò)介導(dǎo)多條代謝通路影響UC和CD的發(fā)生發(fā)展[6]，但具體作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過(guò)對(duì)IBD患者(CD患者及UC患者)外周血血清及其腸黏膜組織中miR-125b與miR-335的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，分析二者與疾病活動(dòng)度、病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性，以期為臨床研究腸道相關(guān)慢性炎癥疾病提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年5月至2019年6月在本院消化內(nèi)科經(jīng)診斷確診的IBD患者117例，其中CD患者62例，男35例，女27例，平均年齡(39.19±6.75)歲；UC患者55例，男34例，女21例，平均年齡(42.91±8.13)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡20～70歲；(2)符合2012年《炎癥性腸病診斷與治療的共識(shí)意見(jiàn)》中關(guān)于UC、CD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]；(3)各項(xiàng)檢查資料完整；(4)患者及患者家屬均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)過(guò)去3個(gè)月內(nèi)使用過(guò)水楊酸制劑、糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及生物制劑等；(2)合并心血管疾病和肝腎疾病；(3)合并惡性腫瘤；(4)合并其他自身免疫性疾?。?5)哺乳及妊娠期婦女。同期招募健康志愿者51例(對(duì)照組)，男32例，女19例，平均年齡(40.26±6.98)歲。在腸鏡下取患者黏膜2塊與對(duì)照者的小腸黏膜2塊置于液氮中保存?zhèn)溆?；分別采集IBD患者與健康對(duì)照者空腹靜脈血4 mL，分離血清置于冰箱備用。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 主要試劑與儀器

RNA提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化有限公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix購(gòu)自南京Vazyme生物公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；本研究引物由西安擎科生物公司合成。

1.3 方法

1.3.1RT-PCR檢測(cè)miR-125b、miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平

從液氮取出腸黏膜組織及血清，采用RNA提取試劑盒(天根)提取組織及血清中的總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得cDNA。采用RT-PCR儀對(duì)miR-125b和miR-335進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RT-PCR反應(yīng)體系共10 μL：miScript SYBR?Green Mix 5.0 μL，cDNA(50 ng/μL)1.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，ddH2O 3.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 90 s；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。miR-125b和miR-335及內(nèi)參U6的引物序列見(jiàn)表1。采用2-ΔΔCT法對(duì)miR-125b、miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.2IBD患者的活動(dòng)度、病變嚴(yán)重程度比較

根據(jù)改良Mayo評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[8]評(píng)估UC患者活動(dòng)度，其中輕度活動(dòng)20例(UC輕度活動(dòng)組)、中度活動(dòng)23例(UC中度活動(dòng)組)、重度活動(dòng)12例(UC重度活動(dòng)組)；根據(jù)CD活動(dòng)指數(shù) (CDAI)[9]評(píng)估CD患者活動(dòng)度，其中輕度活動(dòng)18例(CD輕度活動(dòng)組)、中度活動(dòng)25例(CD中度活動(dòng)組)、重度活動(dòng)19例(CD重度活動(dòng)組)。采用修正Baron評(píng)分系統(tǒng)[8]、CD 內(nèi)鏡嚴(yán)重程度指數(shù)(CDEIS)分別評(píng)估UC、CD患者內(nèi)鏡下病變嚴(yán)重程度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CD患者外周血血清及腸黏膜組織中miR-125b、miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，CD輕度活動(dòng)組、CD中度活動(dòng)組、CD重度活動(dòng)組患者外周血血清及腸黏膜組織中miR-125b、miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平依次降低(P<0.05)，見(jiàn)表2。

表2 miR-125b、miR-335 mRNA在CD患者外周血血清及腸黏膜組織中的表達(dá)

2.2 UC患者外周血血清及腸黏膜組織中miR-125b、miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，UC輕度活動(dòng)組、UC中度活動(dòng)組、UC重度活動(dòng)組患者外周血血清及腸黏膜組織中miR-125b、miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平依次降低(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 miR-125b、miR-335 mRNA在UC患者外周血血清及腸黏膜組織中的表達(dá)

2.3 CD患者活動(dòng)度、病變嚴(yán)重程度比較

CD輕度活動(dòng)組、CD中度活動(dòng)組、CD重度活動(dòng)組患者的CDAI、CDEI均依次升高(P<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表4。

表4 CD患者的CDAI、CDEI比較

2.4 UC患者活動(dòng)度、病變嚴(yán)重程度比較

UC輕度活動(dòng)組、UC中度活動(dòng)組、UC重度活動(dòng)組患者的改良Mayo評(píng)分、修正Baron評(píng)分均依次升高(P<0.05)，進(jìn)一步兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表5。

表5 UC患者的改良Mayo評(píng)分和修正Baron評(píng)分的比較分)

2.5 CD患者血清miR-125b、miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與病變嚴(yán)重程度及活動(dòng)度的相關(guān)性

CD患者外周血血清miR-125b mRNA相對(duì)表達(dá)水平與CDAI、CDEI均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.816、-0.829，P<0.05),見(jiàn)圖1、2；CD患者外周血血清miR-335相對(duì)表達(dá)水平與CDAI、CDEI均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.772、-0.501，P<0.05)。

圖1 CD患者血清miR-125b mRNA相對(duì)表達(dá)水平與疾病活動(dòng)度相關(guān)性分析

圖2 CD患者血清miR-125b mRNA相對(duì)表達(dá)水平與病變 嚴(yán)重程度相關(guān)性分析

2.6 UC患者外周血血清miR-125b、miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與病變嚴(yán)重程度及活動(dòng)度的相關(guān)性

UC患者外周血血清miR-125b mRNA相對(duì)表達(dá)水平與改良Mayo評(píng)分和修正Baron評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.729、-0.779，P<0.05)，見(jiàn)圖5、6；UC患者外周血血清中miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平改良Mayo評(píng)分和修正Baron評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.819、-0.840，P<0.05)，見(jiàn)圖7、8。

圖3 CD患者血清miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與疾病活動(dòng)度相關(guān)性分析

圖4 CD患者血清miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與病變嚴(yán)重程度相關(guān)性分析

圖5 UC患者血清miR-125b mRNA相對(duì)表達(dá)水平與疾病活動(dòng)度相關(guān)性分析

圖6 UC患者血清miR-125b mRNA相對(duì)表達(dá)水平與病變嚴(yán)重程度相關(guān)性分析

圖7 UC患者血清miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與疾病活動(dòng)度相關(guān)性分析

圖8 UC患者血清miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與病變嚴(yán)重程度相關(guān)性分析

3 討 論

IBD疾病是一類非特異性腸道炎癥性疾病，其病因和發(fā)病機(jī)制尚不明確[10]。近年我國(guó)該病發(fā)病率呈不斷上升趨勢(shì)[11]，給人們生活帶來(lái)嚴(yán)重危害，因此對(duì)該病發(fā)病機(jī)制的研究顯得尤為重要。本研究通過(guò)對(duì)本院117例IBD患者外周血血清和腸黏膜組織中miR-125b、miR-335表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，分析外周血血清中miR-125b與miR-335表達(dá)與疾病活動(dòng)度、病變嚴(yán)重程度的相關(guān)性，探索miR-125b、miR-335表達(dá)對(duì)IBD發(fā)生發(fā)展的影響，以期為臨床上更好地治療和控制IBD疾病提供參考。

miRNA是一類起始于細(xì)胞核，成熟于細(xì)胞質(zhì)的非編碼單鏈RNA分子，由19～25個(gè)核苷酸組成[12]，廣泛存在于真核細(xì)胞中，在哺乳動(dòng)物中成熟的miRNA可對(duì)體內(nèi)60%左右的基因進(jìn)行調(diào)節(jié)[13]，人類基因中有2%～3%的miRNA參與體內(nèi)30%左右的基因調(diào)控，miRNA在人體所有組織及血液、尿液、唾液、腦脊液等體液中均可表達(dá)，體液中miRNA與蛋白質(zhì)等構(gòu)成復(fù)合物，可抵抗RNA酶的降解，使得miRNA在體液中具有高度的穩(wěn)定性和保守性[14]。在健康個(gè)體中miRNA的表達(dá)譜較一致，而在不同疾病狀態(tài)下其表達(dá)譜可發(fā)生顯著變化，這種表達(dá)譜的變化往往早于生化及影像學(xué)的改變，是早期診斷疾病的理想潛在標(biāo)志物。劉嫦欽等[15]報(bào)道m(xù)iR-10a在IBD疾病中表達(dá)下調(diào)，對(duì)IBD的發(fā)生發(fā)展具有重要作用。SCH?NAUEN等[16]發(fā)現(xiàn)miR-16、miR-21和miR-223在IBD患者血清中高表達(dá)，參與調(diào)控IBD的發(fā)生發(fā)展。miR-31和miR-155通過(guò)直接和間接靶向IL-13依賴性途徑中的基因，在IBD疾病中表達(dá)上調(diào)[17]，以上均表明多種miRNA參與IBD疾病的發(fā)生發(fā)展，但目前miR-125b、miR-335在IBD疾病中研究報(bào)道較少。miR-125b是miRNAs家族中較為活躍的成員之一，其主要分布在腦部神經(jīng)元細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞中，miR-125b在調(diào)節(jié)炎癥、免疫活動(dòng)和凝血方面均具有重要的作用。目前國(guó)外文獻(xiàn)已經(jīng)證明miR-125b在UC患者結(jié)腸黏膜組織中呈高表達(dá)，其可能是通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥信號(hào)通路MARK/NFkB等促進(jìn)炎癥細(xì)胞及相關(guān)介體的傳播[18]。同時(shí)還有文獻(xiàn)顯示[19]，miR-125b與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后不良密切相關(guān)，其可作為結(jié)直腸癌的預(yù)后標(biāo)志物。miR-335在人類定位與染色體7q32.2，其主要作用是調(diào)節(jié)人干細(xì)胞的增殖、遷移和分化，經(jīng)過(guò)采用生物信息研究分析發(fā)現(xiàn)miR-335可能參與IBD過(guò)程，但是具體的機(jī)制尚不明確。而本研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照者比較，輕度活動(dòng)、中度活動(dòng)、重度活動(dòng)CD患者及UC患者外周血血清和腸黏膜組織中miR-335、miR-125b mRNA相對(duì)表達(dá)水平均明顯下降，提示miR-335與miR-125b表達(dá)可能與IBD發(fā)生發(fā)展過(guò)程有關(guān)。

UC是IBD的主要類型，其發(fā)病機(jī)制可能與遺傳、感染及自身免疫有關(guān)，CD是一種目前原因不明的慢性肉芽腫性炎癥性疾病，異常的自身免疫可能與發(fā)病有關(guān)[20]。UC和CD的主要區(qū)別在于UC的發(fā)病部位主要在結(jié)腸和直腸，而CD可影響整個(gè)消化道[21]，且兩者基因表達(dá)譜及細(xì)胞表現(xiàn)差異明顯。本研究結(jié)果顯示，UC患者外周血血清中miR-125b、miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與Mayo評(píng)分、修正Baron評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)；CD患者外周血血清中miR-125b、miR-335 mRNA相對(duì)表達(dá)水平與CDAI、CDEIS均呈負(fù)相關(guān)，說(shuō)明外周血血清miR-125b、miR-335表達(dá)與UC患者及CD患者疾病活動(dòng)度、病變嚴(yán)重程度均有關(guān)，提示外周血血清miR-125b、miR-335表達(dá)水平也許可作為評(píng)估UC患者及CD患者疾病活動(dòng)度、病變嚴(yán)重程度的指標(biāo)。

綜上所述，miR-125b、miR-335在UC患者及CD患者外周血血清和腸黏膜組織中表達(dá)下調(diào)，miR-125b、miR-335在外周血血清中的表達(dá)與UC患者及CD患者疾病活動(dòng)度和病變嚴(yán)重程度有關(guān)，其有望成為評(píng)估IBD疾病活動(dòng)度的指標(biāo)，但由于本研究樣本量較少，其結(jié)論準(zhǔn)確性尚需進(jìn)一步擴(kuò)充樣本量加以驗(yàn)證。