慢性心力衰竭患者血清miR-30a、miR-101a表達(dá)及其與心肌重構(gòu)和心功能的相關(guān)性*

高 敏，吳 藝，高守君，郝麗琴

(1.四川省雅安市人民醫(yī)院急診科 625000；2.四川省雅安市第四人民醫(yī)院老年科 625000)

慢性心力衰竭(chronic heart failure，CHF)是一種臨床常見(jiàn)疾病，是各種心臟疾病的終末階段[1]。據(jù)報(bào)道顯示，全球CHF發(fā)病率為1.5%～2.0%，病死率為5.6%～15.4%，近年隨著我國(guó)人口老齡化加速，CHF發(fā)病率呈逐年增加趨勢(shì)，嚴(yán)重影響患者生命健康，給社會(huì)及患者家庭帶來(lái)沉重負(fù)擔(dān)[2]。目前CHF發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，臨床多采用對(duì)癥治療，這對(duì)患者預(yù)后改善效果不佳。有研究報(bào)道，神經(jīng)內(nèi)分泌過(guò)度激活和心肌重構(gòu)是CHF發(fā)生的重要機(jī)制，早期發(fā)現(xiàn)并逆轉(zhuǎn)心肌重構(gòu)是CHF療效的關(guān)鍵[3-4]。微RNA(microRNA，miRNA)是一種高度保守的單鏈非編碼小RNA，參與機(jī)體和細(xì)胞的多種生物學(xué)功能，且其表達(dá)具有組織和細(xì)胞特異性。越來(lái)越多研究表明，miRNA在心力衰竭、心肌梗死、心律失常等心血管疾病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用[5-8]。研究報(bào)道，血清miR-30a水平與先天性心臟病心功能變化有關(guān)，miR-101a下調(diào)與房顫電重構(gòu)機(jī)制有關(guān)[9-10]，miR-101a和miR-30b有助于減輕β-細(xì)胞炎癥因子引起的機(jī)體功能障礙[11]，但關(guān)于血清miR-30a、miR-101a與CHF的關(guān)系鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究通過(guò)觀察血清miR-30a、miR-101a表達(dá)水平變化，探究其與CHF患者心肌重構(gòu)及心功能的關(guān)系，以期為臨床CHF患者治療提供一定理論指導(dǎo)。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年3月至2019年6月四川省雅安市人民醫(yī)院收治的住院治療的CHF患者128例為CHF組，其中男74例，女54例，年齡39～76歲，平均(68.19±8.28)歲。CHF診斷參照《中國(guó)心力衰竭診斷和治療指南(2014)》[12]：(1)有心臟病史、癥狀及體征；(2)水腫、乏力、呼吸困難等癥狀持續(xù)時(shí)間超過(guò)半年；(3)左室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LEVF)保留；(4)運(yùn)動(dòng)耐力明顯下降。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合CHF診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)年齡35～80歲；(3)男性左室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end-diastolic diameter，LVEDD)>55 mm，女性LVEDD>50 mm；(4)臨床檢查資料完整且自愿配合調(diào)查研究。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)入院前1個(gè)月接受經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入術(shù)治療者；(2)有急性心肌梗死、不穩(wěn)定性心絞痛、急性心肌炎等其他心臟疾病者；(3)合并肝、腎、甲狀腺等重要臟器功能障礙者；(4)合并心臟瓣膜性、慢性阻塞性肺疾病及肺動(dòng)脈栓塞者。進(jìn)一步參照紐約心臟病協(xié)會(huì)(New York Heart Association，NYHA)心功能分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)及6 min步行試驗(yàn)結(jié)果，由兩名內(nèi)科主治醫(yī)師評(píng)定分為：日?；顒?dòng)無(wú)或有輕微癥狀，休息時(shí)癥狀無(wú)且6 min步行距離大于450 m的患者為NYHA心功能分級(jí)Ⅰ+Ⅱ級(jí)，共41例；日?；顒?dòng)明顯受限，休息時(shí)無(wú)癥狀且6 min步行距離150～450 m的患者為NYHA心功能分級(jí)Ⅲ級(jí)，共50例；活動(dòng)嚴(yán)重受限，休息狀態(tài)下可出現(xiàn)心力衰竭(HF)癥狀且6 min步行距離小于150 m的患者為NYHA心功能分級(jí)Ⅳ級(jí)，共37例。另取同期門(mén)診體檢健康者50例為對(duì)照組，其中男28例，女22例，年齡39～79歲，平均(67.23±8.16)歲。CHF各分級(jí)患者與對(duì)照組年齡、性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)過(guò)四川省雅安市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)通過(guò)，收集受試者所有臨床檢查資料，所有樣品采集及資料調(diào)查均取得患者及其家屬知情同意并簽字確認(rèn)，符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》。

1.2 試劑及主要儀器

TRIzol試劑(貨號(hào)R0016，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)試劑盒(貨號(hào)638316)、PrimeScriptTMRT reagent Kit (Perfect Real Time，貨號(hào)RR037A)購(gòu)自日本TaKaRa公司，引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成；紫外分光光度計(jì)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司、RT-PCR儀7500型購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1血清miR-30a、miR-101a mRNA水平檢測(cè)

采集患者入院第2天清晨空腹肘靜脈外周血4 mL，3 500 r/min離心10 min，分離血清置于-80 ℃冰箱待檢。采用TRIzol提取血清總RNA，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)總 RNA 濃度及純度，當(dāng)260 nm與280 nm處理吸光度值比值(A260/A280)為1.8～2.0時(shí)為樣品合格。逆轉(zhuǎn)錄獲得模板cDNA，置于-20 ℃保存?zhèn)溆?。RT-PCR檢測(cè)miR-30a、miR-101a mRNA相對(duì)表達(dá)水平，采用20 μL反應(yīng)體系：SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×) 10.0 μL，ROX Ⅱ(50×) 0.4 μL，cDNA(50 ng/ μL) 2.0 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。反應(yīng)條件設(shè)置為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；添加溶解曲線。miR-30a上游引物序列5′-GTC GTA TCC AGT GCA GGG TCC GAG-3′，下游引物序列5′-CAC AGC TCG TAG AAC AGG AGG-3；miR-101a上游引物序列5′-TAC AGT ACT GTG AUA ACT GAA-3′，下游引物序列5′-CAG TTA TCA GTA CTG TAT T-3′；內(nèi)參U6上游引物序列5′-GCT TCG GCA GCA CAT ATA CTA AAA T-3′，下游引物序列5′-CGC TTC ACG AAT TTG CGT GTC AT-3′。采用2-ΔΔCt法對(duì)血清miR-30a、miR-101a mRNA相對(duì)水平進(jìn)行定量分析。

1.3.2超聲心動(dòng)圖檢查

由同一名指定超聲醫(yī)師采用Philips IE33超聲儀，參照美國(guó)超聲心動(dòng)圖學(xué)會(huì)推薦的方法檢測(cè)心肌重構(gòu)及心功能相關(guān)指標(biāo)[13]，主要包括心輸出量(cardiac output，CO)、LVEF、左室后壁厚度(left ventricular posterior wall thickness,LVPW)、LVEDD、左房?jī)?nèi)徑(left atrial diameter，LAD)、左室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)、左室重構(gòu)指數(shù)(left ventricular reconsitution index，LVRI)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CHF患者與對(duì)照組血清miR-30a、miR-101a mRNA相對(duì)表達(dá)水平比較

與對(duì)照組比較，CHF組各分級(jí)患者miR-30a、miR-101a mRNA水平均升高，miR-101a mRNA水平均降低，且隨心功能分級(jí)增加血清miR-30a mRNA水平逐級(jí)升高，miR-101a mRNA水平逐級(jí)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 CHF患者與對(duì)照組血清miR-30a、miR-101a mRNA水平比較

2.2 CHF患者與對(duì)照組心肌重構(gòu)和心功能指標(biāo)比較

與對(duì)照組比較，CHF組患者CO、LVEF、LVRI均降低，且隨心功能分級(jí)增加而逐級(jí)降低，LVPW、LVEDD、LAD、LVMI均升高，且隨心功能分級(jí)增加而逐級(jí)升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 CHF組患者與對(duì)照組心肌重構(gòu)和心功能指標(biāo)比較

2.3 CHF患者血清miR-30a、miR-101a mRNA水平相關(guān)性分析

CHF組患者血清miR-30a水平與miR-101a水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.864，P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 CHF患者血清miR-30a、miR-101a mRN水平相關(guān)性分析

2.4 CHF患者血清miR-30a、miR-101a mRNA水平與心肌重構(gòu)和心功能指標(biāo)的相關(guān)性分析

CHF組患者血清miR-30a mRNA水平與CO、LVEF、LVRI呈負(fù)相關(guān)，與LVPW、LAD、LVMI呈正相關(guān)(均P<0.05)；CHF患者血清miR-101a mRNA水平與CO、LVEF、LVRI呈正相關(guān)，與LVPW、LAD、LVMI呈負(fù)相關(guān)(均P<0.05)，血清miR-30a、miR-101a mRNA水平與LVEDD無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 CHF患者血清miR-30a、miR-101a mRNA相對(duì)表達(dá)水平與心肌重構(gòu)和心功能指標(biāo)的相關(guān)性

3 討 論

CHF作為各種心臟疾病的終末期，臨床表現(xiàn)極為復(fù)雜，其中多表現(xiàn)為心臟收縮或(和)舒張功能障礙，患者心功能逐漸惡化，左心室排血障礙，引起神經(jīng)、內(nèi)分泌等多系統(tǒng)代償性變化，心肌細(xì)胞外心包信號(hào)異常、膠原異常沉積、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)等，最終引起心肌重構(gòu)，心肌重構(gòu)是機(jī)體對(duì)損傷的一種適應(yīng)性反應(yīng)，其嚴(yán)重程度與心功能分級(jí)密切相關(guān)[2,14]。CO、LVEF、左室收縮末期直徑(LVESD)、左室收縮末期容積(LVESV)等可反映CHF患者左心室收縮功能，LVEDD、LVPW可反映左心室、左心房壁厚度，LAD、LVMI、LVRI可反映患者心肌重構(gòu)整體情況[2-3]。丁玫等[15]研究發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組比較，CHF患者LVPW、LAD、LVEDD顯著升高。龔進(jìn)坤等[16]研究報(bào)道，CHF患者LVESD、LVD、RVD均高于健康對(duì)照組，且與CHF失代償組比較，CHF代償組患者LVEF升高，LVESD、LVESV降低。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，CHF組患者CO、LVEF、LVRI均降低，且隨心功能分級(jí)增加而逐級(jí)降低，LVPW、LVEDD、LAD、LVMI均升高，且隨心功能分級(jí)增加而逐級(jí)升高，提示CO、LVEF、LVPW、LVEDD、LAD、LVMI、LVRI可作為反映心功能及心肌重構(gòu)的指標(biāo)。

miRNA是一類長(zhǎng)度18～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性單鏈非編碼RNA，在機(jī)體各組織中廣泛表達(dá)，通過(guò)與mRNA 3′端非編碼區(qū)靶向結(jié)合調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄后的表達(dá)。徐振宇等[2]研究報(bào)道，血清miR-133a、miR-133b水平隨CHF患者心功能分級(jí)增加而升高，與CHF患者心肌重構(gòu)及心功能有關(guān)。劉雪貞等[9]研究報(bào)道，先天性心臟病合并CHF患兒血清miR-30a水平顯著高于單純先天性心臟病患兒及健康對(duì)照組兒童。李艷茹等[10]研究報(bào)道，與健康對(duì)照組比較，房顫組乳鼠心房細(xì)胞miR-101a、miR-101b水平顯著下調(diào)，與房顫電重構(gòu)機(jī)制有關(guān)。ROUX等[11]研究報(bào)道，miR-30a、miR-101a水平在炎癥因子介導(dǎo)的Ⅰ型糖尿病胰島β-細(xì)胞功能失調(diào)過(guò)程中起重要作用，白細(xì)胞介素(IL)-1β可增加MIN6細(xì)胞中miR-30a、miR-101a水平，二者水平與胰島-β細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組比較，CHF患者血清miR-30a mRNA水平升高，且隨CHF患者心功能分級(jí)增加逐級(jí)升高，血清miR-101a mRNA水平降低，且隨心功能分級(jí)增加逐級(jí)降低，提示血清miR-30a mRNA水平上調(diào)，miR-101a mRNA水平下調(diào)可能與CHF發(fā)生有關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，CHF患者血清miR-30a mRNA水平與miR-101a mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，miR-30a mRNA水平與CO、LVEF、LVRI呈負(fù)相關(guān)，與LVPW、LAD、LVMI呈正相關(guān)；miR-101a mRNA水平與CO、LVEF、LVRI呈正相關(guān)，與LVPW、LAD、LVMI呈負(fù)相關(guān)，提示miR-30a、miR-101a可能與CHF患者心肌重構(gòu)和心功能有關(guān)，監(jiān)測(cè)血清miR-30a、miR-101a mRNA水平可能對(duì)CHF患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后評(píng)估有一定指導(dǎo)意義。

綜上所述，血清miR-30a、miR-101a mRNA水平隨CHF患者心功能分級(jí)增加分別升高和降低，與心肌重構(gòu)和心功能密切相關(guān)，可能對(duì)CHF患者病情嚴(yán)重程度及預(yù)后評(píng)估有一定指導(dǎo)意義。但由于本研究樣本量小且關(guān)于miR-30a、miR-101a在CHF心肌重構(gòu)過(guò)程的具體調(diào)控機(jī)制仍未知，后期仍需加大樣本量進(jìn)一步深入探討。