妊娠期鉛、鎘暴露對新生大鼠海馬BDNF及ZnT7蛋白表達的影響*

路艷清，孫 蕾，王雪芳

(1.甘肅省蘭州市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 730046;2.甘肅省武威市人民醫(yī)院婦產(chǎn)科 733000)

隨著工業(yè)化和城市化進程的加快，環(huán)境鉛(plumbum，Pb)、鎘(cadmium，Cd)污染對人體健康尤其是兒童生長發(fā)育及智力、行為健康的影響已成為社會關(guān)注問題之一[1-2]。Pb是一種具有神經(jīng)毒性的重金屬，Cd也是一種廣泛存在于工農(nóng)業(yè)和日常生活中的重金屬類環(huán)境污染物，其環(huán)境含量呈逐年上升趨勢，可毒害女性生殖系統(tǒng)、發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)及小兒體格和神經(jīng)發(fā)育[3]。以往研究證實，母體血Pb、Cd與臍血Pb、Cd有一定相關(guān)性[4]，但關(guān)于妊娠期暴露Pb、Cd對新生兒的作用機制尚不完全清楚。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)在神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等廣泛表達，對神經(jīng)元的生長、發(fā)育、分化及再生具有維持和促進作用[5-6]。鋅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中水平豐富，其穩(wěn)態(tài)對維持腦正常生理功能起重要作用，其水平變化與鋅轉(zhuǎn)移體(Zinc transporter，ZnT)直接相關(guān)[7]。因此本研究擬通過對母鼠妊娠期Pb、Cd暴露進行研究，旨在探究其對新生大鼠海馬中BDNF及ZnT7蛋白表達的影響，以期為Pb、Cd的神經(jīng)毒性作用機制及臨床預防和治療Pb、Cd毒性損傷提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

12只健康清潔級妊娠SD大鼠由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，分成4組：對照組(NC組，飲用蒸餾水)、鉛組(Pb組，300 mg/L)、鎘組(Cd組，10 mg/L)及鉛鎘聯(lián)合組(Pb+Cd組，300 mg/L+10 mg/L)，每組3只。均維持12 h光照/12 h黑暗循環(huán)，環(huán)境溫度22～24 ℃，濕度45%～65%，自由采食，均從妊娠第1天至妊娠結(jié)束共飲水染毒21 d。動物的飼養(yǎng)和使用均符合美國國立衛(wèi)生研究院指南及動物倫理保護有關(guān)準則。

1.2 主要試劑及儀器

醋酸鉛(546-67-8)購自上海一基實業(yè)有限公司；醋酸鎘(15280-53-2)購自湖北巨勝科技有限公司；蛋白抽提試劑盒(P0028)、BCA蛋白定量試劑盒(P0010S)購自上海碧云天有限公司；一抗兔源抗BDNF(ab108319)、抗ZnT7蛋白(ab223065)、抗GAPDH(ab181602)抗體購自英國Abcam公司等；FC酶標儀購自美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1采樣

每組選取16只21 d齡新生大鼠(每窩取5～6只)腹腔注射10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)麻醉處死，采集各組新生大鼠腹主動脈血2 mL于肝素鋰抗凝真空管中，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。斷頭取腦部海馬組織后迅速置于液氮中保存待用。

1.3.2新生大鼠認知能力評定

采樣前采用水迷宮實驗測定新生大鼠認知能力。水迷宮體積為80 cm×50 cm×20 cm，水深9 cm，水溫(22±2)℃，內(nèi)設(shè)多盲端曲折回路，終點處設(shè)置梯子供新生大鼠爬出水面進入可視平臺。第1次訓練前將新生大鼠放在梯子附近，使其自行爬上3次，以后每次訓練前，均使其自行爬上梯子1次。每只新生大鼠每天訓練1次，每次120 s，連續(xù)4 d。分別記錄每只新生大鼠從入水至到達平臺所需時間(逃避潛伏期)及進入盲端次數(shù)，以此作為新生大鼠的認知能力檢測指標。

1.3.3血液及海馬組織Pb、Cd水平測定

血液及海馬組織標本經(jīng)濃硝酸消解后，采用PE700Z型原子吸收光譜儀測定Pb、Cd水平。

1.3.4海馬組織BDNF、ZnT7表達水平檢測

采用蛋白免疫印跡(Western blot)法檢測海馬組織BDNF、ZnT7蛋白表達。首先提取新生大鼠海馬組織總蛋白，采用BCA法測定蛋白濃度，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳，將分離的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉，分別加入一抗抗-BDNF(稀釋比1∶2 000)、抗-ZnT7(稀釋比1∶2 000)，抗-GAPDH抗體(稀釋比1∶10 000)，4 ℃孵育過夜，洗膜，添加二抗IgG(1∶5 000)室溫孵育1.5 h，洗膜，顯色，曝片，觀察并分析蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 各組新生大鼠血液及海馬組織Pb、Cd水平比較

與NC組比較，Pb組、Pb+Cd組新生大鼠血液及海馬組織中Pb水平均顯著增加(P<0.05)，Cd組、Pb+Cd組新生大鼠血液及海馬組織中Cd水平均顯著增加(P<0.05)，見表1。

表1 各組新生大鼠血液及海馬組織Pb、Cd水平比較

2.2 各組新生大鼠認知能力比較

與NC組比較，Pb組、Cd組及Pb+Cd組新生大鼠逃避潛伏期及進入盲端次數(shù)顯著增加(P<0.05)，其中以Pb+Cd組最多(P<0.05)，見表2。

表2 各組新生大鼠認知能力比較

2.3 各組新生大鼠海馬BDNF、ZnT7水平比較

與NC組比較，Pb組、Cd組及Pb+Cd組新生大鼠海馬組織中BDNF水平顯著降低，其中以Pb+Cd組最低(P<0.05)，ZnT7水平顯著升高，其中以Pb+Cd組最高(P<0.05)。見表3、圖1。

表3 各組新生大鼠海馬BDNF、ZnT7蛋白相對表達水平比較

圖1 Western blot檢測新生大鼠海馬組織中BDNF、ZnT7蛋白表達

2.4 相關(guān)性分析

Pb+Cd組新生大鼠海馬組織中BDNF水平與血液及海馬Pb、Cd水平均呈負相關(guān)(P<0.05)，ZnT7水平與血液及海馬Pb、Cd水平均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 Pb+Cd組新生大鼠海馬組織中BDNF、ZnT7水平與血液及海馬Pb、Cd水平的相關(guān)性

3 討 論

環(huán)境重金屬污染已成為嚴重影響人類健康的公共衛(wèi)生事件之一，其中以Pb、Cd污染最為嚴重[8-9]。研究報道，我國育齡期婦女近20%血Pb超過100 μg/L，且母體血Pb極易通過胎盤轉(zhuǎn)運給胎兒，對胎兒造成各種傷害[10]。Cd主要存在于塵埃、土壤、水和食物中，亦可通過胎盤屏障進入胎兒體內(nèi)，母體Cd是胎兒Cd暴露的唯一來源，其在體內(nèi)的生物半衰期長達10～30年，在體內(nèi)蓄積可嚴重影響小兒生長發(fā)育[11]。孕期是母子兩代生命銜接的非常時期，此時孕婦及胎兒對環(huán)境毒物更加敏感，所以與出生后暴露相比，各種毒性元素出生前暴露對生長發(fā)育的毒性作用更大。目前，單一重金屬損害健康已得到廣泛研究，但實際環(huán)境中，這些重金屬并非單獨存在。因此，為探究出生前Pb、Cd暴露對新生兒的毒害作用，本研究以妊娠SD大鼠為實驗模型，分別通過Pb、Cd單獨及聯(lián)合飲水染毒，評價其對新生大鼠神經(jīng)功能的影響及可能機制。彭博等[12]研究報道，Pb暴露可導致小鼠學習記憶功能障礙及海馬蛋白激酶B表達降低。李宗光等[13]研究報道，低劑量汞、Pb、Cd聯(lián)合暴露可起協(xié)同神經(jīng)毒性損傷作用，與海馬神經(jīng)元凋亡、活性氧及鈣離子變化有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，與NC組比較，Pb組、Pb+Cd組新生大鼠血液及海馬組織中Pb水平均顯著增加，Cd組、Pb+Cd組新生大鼠血液及海馬組織中Cd水平均顯著增加，提示妊娠期母鼠Pb、Cd暴露可能通過胎盤轉(zhuǎn)運至新生大鼠，臨床應建議女性孕前3個月進行血Pb、Cd檢查，以防止其含量過高影響胎兒發(fā)育。本研究還發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，Pb組、Cd組及Pb+Cd組21 d齡新生大鼠逃避潛伏期及進入盲端次數(shù)顯著增加，其中以Pb+Cd組最多，提示妊娠期母鼠Pb、Cd暴露可能影響新生大鼠認知能力，且二者具有協(xié)同作用。

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，廣泛分布于中樞、周圍神經(jīng)系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)等，可促進中樞神經(jīng)元生長、分化、損傷修復、增強突觸信息傳遞、存儲及提高記憶、認知功能[14]。牛佳媛等[15]研究報道，缺血缺氧性腦損傷新生大鼠水迷宮實驗中逃避潛伏期延長，海馬組織BDNF水平顯著降低。孫向峰等[16]研究報道，缺氧缺血性腦損傷新生大鼠學習記憶能力及海馬BDNF水平顯著降低。大腦發(fā)揮正常功能亦需要一定水平的Zn2+維持穩(wěn)定，但過量的Zn2+可對大腦產(chǎn)生毒性，造成神經(jīng)元損傷，而Zn2+轉(zhuǎn)運需要以ZnT為載體[17]。粟立羽等[18]研究報道，錳中毒可破壞大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元細胞結(jié)構(gòu)，增加海馬組織中Zn2+水平及ZnT3表達。ZnT7是一種定位在高爾基體復合體上的蛋白，可將Zn2+從細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)運至高爾基復合體內(nèi)，參與各種調(diào)解細胞基因表達的DNA結(jié)合蛋白等含Zn2+蛋白的合成與加工[19]。池志宏等[20]研究報道，ZnT7在阿爾茲海默癥患者腦內(nèi)高表達，沉默其表達可明顯抑制APP細胞轉(zhuǎn)基因β淀粉樣蛋白(Aβ)分泌，可作為AD治療的潛在靶點。FRAZZINI等[21]研究報道，Zn2+是神經(jīng)元和大腦活動的多效性調(diào)節(jié)劑，腦Zn2+的藥理學失衡會損害BDNF相關(guān)信號通路和幼鼠的認知能力。本研究結(jié)果顯示，與NC組比較，Pb、Cd暴露可顯著降低新生大鼠海馬BDNF水平、提高ZnT7蛋白水平，均以Pb+Cd聯(lián)合作用最顯著，且Pb+Cd組新生大鼠海馬BDNF水平與血液、海馬Pb、Cd水平均呈負相關(guān)，Pb+Cd組新生大鼠海馬ZnT7水平與血液、海馬Pb、Cd水平均呈正相關(guān)，提示妊娠期Pb、Cd聯(lián)合暴露降低新生大鼠的認知能力可能與BDNF表達降低、ZnT7表達升高有關(guān)，推測其原因可能是Pb、Cd增加導致Zn2+代謝紊亂、Zn2+穩(wěn)態(tài)平衡破壞，進而影響ZnT7及BDNF表達水平。

綜上所述，Pb、Cd聯(lián)合表現(xiàn)為協(xié)同毒性效應，妊娠期Pb、Cd暴露可顯著降低新生大鼠海馬BDNF表達，提高ZnT7蛋白表達，影響新生大鼠認知能力，可能為臨床預防和治療Pb、Cd毒性損傷提供一定理論依據(jù)。但本研究尚存在不足之處，其中關(guān)于Pb、Cd影響B(tài)DNF、ZnT7表達的具體作用通路機制尚不清楚，有待進一步深入探究。