丙戊酸鈉對(duì)50%TBSAⅢ度燙傷大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響*

孟祥熙，溫海玲，吳曉明，胡 森

(1.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院燒傷整形科，河北承德 067000；2.解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心燒傷研究所休克與多器官障礙實(shí)驗(yàn)室，北京 100048)

嚴(yán)重?zé)齻?，有效循環(huán)血量減少，組織缺血缺氧，引起心肌損傷、心功能降低、循環(huán)功能降低，心肌損害程度與心肌細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)等密切相關(guān)，燒傷早期對(duì)心臟功能的保護(hù)、提高心肌細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受尤為重要，為后續(xù)治療爭取時(shí)間[1-3]。以往研究顯示丙戊酸鈉(VPA)能保護(hù)失血性休克或致死性燙傷大鼠心肌功能，改善心肌能量代謝，提高生存率，但具體機(jī)制仍不明確[4-7]。為此，本實(shí)驗(yàn)通過觀察VPA對(duì)50%體表總面積(TBSA)Ⅲ度燙傷大鼠心肌酶指標(biāo)、心肌細(xì)胞凋亡情況及心肌組織內(nèi)caspase-3活性、一氧化氮合酶(iNOS)表達(dá)水平、NO水平的影響，為VPA在嚴(yán)重?zé)齻缙诒Ｗo(hù)心臟功能研究方面提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

雄性SD大鼠，60～70 d齡，體重240～260 g，購進(jìn)后適應(yīng)性飼養(yǎng)1周以上，室溫維持在22～25 ℃，自由飲食。實(shí)驗(yàn)前12 h禁食、自由飲水。

1.2 藥品和試劑

VPA、戊巴比妥鈉、caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(Assay Kit)購自美國Sigma公司；TUNEL檢測(cè)陽性對(duì)照制備試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；NO檢測(cè)試劑盒購自南京建成生物工程公司；iNOS一抗購自美國Abcam公司；小鼠抗大鼠三磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

48只雄性SD大鼠，戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔麻醉，剪除背部和腹部的毛發(fā)，將大鼠放置在預(yù)制模板的矩形開口，露出裸露皮膚，同時(shí)保護(hù)剩余皮膚。分為3組(n=16)，(1)假燙組：于37 ℃水浴中背部浸泡15 s，腹部浸泡8 s，浸泡后腹腔內(nèi)注射0.25 mL生理鹽水;(2)燙傷組：于100 ℃水浴中背部浸泡15 s、腹部浸泡8 s燙傷后，腹腔內(nèi)注射0.25 mL生理鹽水；(3)VPA 組：燙傷后腹腔給予VPA治療(300 mg/kg，溶于0.25 mL 0.9%生理鹽水)。

1.4 指標(biāo)檢測(cè)

燙傷后3、6 h行腹主動(dòng)脈穿刺，取血標(biāo)本；然后處死大鼠，胸正中線剖開取心肌組織。

1.4.1磷酸肌酸激酶同工酶(CK-MB)水平檢測(cè)

血標(biāo)本離心后取血漿，全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血漿CK-MB水平。

1.4.2心肌細(xì)胞凋亡率

TUNEL方法檢測(cè)凋亡心肌細(xì)胞，其原理為熒光素標(biāo)記的脫氧尿嘧啶核苷酸三磷酸(dUTP)在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT Enzyme)的作用下，可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂DNA的3′-OH末端，在熒光顯微鏡下熒光增強(qiáng)。隨機(jī)選取心肌組織區(qū)域中5個(gè)非重疊400高倍鏡視野，計(jì)數(shù)凋亡心肌細(xì)胞數(shù)和心肌細(xì)胞總數(shù)，心肌細(xì)胞凋亡率=凋亡心肌細(xì)胞數(shù)/心肌細(xì)胞總數(shù)×100%

1.4.3caspase-3活性檢測(cè)

casepase-3可以催化底物DEVD-p-NA產(chǎn)生黃色的p-NA，從而可以通過測(cè)定吸光度來檢測(cè)caspase-3的活性；按照試劑盒說明書進(jìn)行操作，405 nm處讀取各管吸光度(A)值，觀察caspase-3活性。

1.4.4NO水平檢測(cè)

NO化學(xué)性質(zhì)活潑，遇氧和水生成硝酸鹽(NO3-)和亞硝酸鹽(NO2-)，后兩者遇顯色劑生成淡紅色偶氮化合物，通過比色可間接檢測(cè)NO水平。按照試劑盒說明書進(jìn)行操作混勻后，550 nm處測(cè)各管A值，根據(jù)公式計(jì)算組織NO水平(μmol/gprot)。

1.4.5iNOS表達(dá)水平

稱取100 mg大鼠心肌組織，加入1 mL RIPA裂解液勻漿，于冰上靜置20 min后12 000×g離心20 min，吸取上清液并用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測(cè)定。行常規(guī)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉60 min后分別加入相應(yīng)一抗：內(nèi)參蛋白小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體(1∶5 000)，兔抗大鼠iNOS抗體(1∶400)，4 ℃孵育過夜；TBST洗3次，每次15 min，然后分別加入相應(yīng)二抗(1∶5 000)，室溫孵育30 min；TBST洗3次，每天15 min，用超敏ECL化學(xué)發(fā)光液發(fā)光、曝光、顯影、定影，用Image J軟件分析條帶灰度。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 CK-MB水平

與假燙組比較，燙傷組傷后3、6 h CK-MB水平顯著升高(均P<0.05)，而VPA組CK-MB水平較燙傷組顯著降低(均P<0.05)，見表1。

表1 各組血漿中CK-MB水平

2.2 TUNEL染色結(jié)果及心肌細(xì)胞凋亡率

燙傷組大鼠心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，肌間隙出現(xiàn)水腫、增寬，肌纖維排列紊亂、斷裂，隨時(shí)間增加心肌損傷逐漸加重;而VPA組的病理變化較燙傷組明顯減輕,心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯減少，肌纖維排列整齊,VPA抑制了心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)了心肌結(jié)構(gòu)及功能，見圖1。燙傷組傷后3、6 h心肌細(xì)胞凋亡率顯著高于假燙組(均P<0.05)，且傷后時(shí)間越長，心肌細(xì)胞凋亡率越高，而VPA處理后心肌細(xì)胞凋亡率較燙傷組各時(shí)間點(diǎn)明顯降低(均P<0.05)。見表2。

A:假燙組;B:燙傷組3 h;C:VPA組3 h;D:燙傷組6 h;E:VPA組6 h。

表2 各組心肌細(xì)胞凋亡率

2.3 心肌組織caspase-3活性

傷后3、6 h，燙傷組caspase-3活性(0.716±0.052、0.912±0.063)顯著高于假燙組(0.435±0.034)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.167，P=0.036；t=23.734，P=0.011)；而VPA組caspase-3活性(0.527±0.046、0.672±0.047)均顯著低于燙傷組(t=-10.245，P=0.036；t=-11.689，P=0.032)。見圖2。

a：P<0.05，與假燙組比較；b：P<0.05，與燙傷組比較。

2.4 心肌組織iNOS相對(duì)表達(dá)水平

假燙組心肌內(nèi)iNOS少量表達(dá)(0.38±0.02)，燙傷組傷后3、6 h心肌組織內(nèi)iNOS相對(duì)表達(dá)水平明顯增加(1.02±0.05、1.41±0.06)，較假燙組顯著升高(t=45.255，P=0.019；t=55.906，P=0.004)，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；而VPA組iNOS相對(duì)表達(dá)水平顯著降低(0.80±0.07、1.13±0.03)，與燙傷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-8.312，P=0.001；t=-14.033，P=0.024)。見圖3。

a：P<0.05，與假燙組比較：b：P<0.05，與燙傷組對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較。

2.5 心肌組織NO水平

與假燙組比較(0.065±0.005)，燙傷組傷后3、6 h心肌組織內(nèi)NO水平(0.157±0.005、0.237±0.007)顯著增加，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=43.718，P=0.010；t=71.070，P=0.000)；而VPA治療后NO水平(0.123±0.010；0.203±0.005)較燙傷組均顯著降低(t=-9.874，P=0.008；t=-13.410，P=0.005)。見圖4。

a：P<0.05，與假燙組比較：b：P<0.05，與燙傷組比較。

3 討 論

嚴(yán)重血容量丟失、燒/燙傷后，組織及各臟器灌注不足，極易引起心肌細(xì)胞的損傷或凋亡[8-10]，在傷員不能及時(shí)得到救治的情況下，如果給予抗休克維持藥物提高傷員對(duì)休克的耐受能力，保護(hù)休克狀態(tài)下的組織細(xì)胞，維持生命臟器的功能，就能為后繼治療爭取時(shí)間，提高生存率。心臟功能的維持及保護(hù)，在休克救治過程中尤為重要，如何利用休克維持藥物提高心肌細(xì)胞對(duì)缺血缺氧的耐受能力、抑制心肌細(xì)胞凋亡，成為近年來研究熱點(diǎn)。

VPA是一種組蛋白去乙?；敢种苿?，近年研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；敢种苿┚哂屑?xì)胞保護(hù)、抗氧化、抗炎等作用[11-14]。LUO等[15]通過大鼠致死性燙傷模型，證實(shí)VPA能增加心臟和大腦中組蛋白H3乙?；剑种芻aspase-3活性，保護(hù)心臟和大腦功能，提高生存率[15]。本實(shí)驗(yàn)通過建立50% TBSAⅢ度燙傷大鼠模型，研究VPA對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響。心臟是維持生命的重要器官，在嚴(yán)重?zé)齻行呐K功能最易受到影響，心肌細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，心臟功能降低。本實(shí)驗(yàn)研究表明，在大鼠致死性燙傷后，血漿CK-MB、心肌細(xì)胞凋亡率顯著升高，VPA治療后，血漿CK-MB水平明顯下降，心肌細(xì)胞凋亡率明顯降低，證明VPA能保護(hù)致死性燙傷大鼠心臟功能，抑制心肌細(xì)胞凋亡。

嚴(yán)重燙傷后，心肌細(xì)胞缺血缺氧，早期心肌出現(xiàn)功能損傷，心肌不斷丟失，嚴(yán)重燙傷早期心功能的損傷與心肌細(xì)胞的凋亡有關(guān)。caspase-3是重要的促凋亡因子，參與心肌細(xì)胞凋亡，活化后發(fā)揮凋亡執(zhí)行因子的作用，標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進(jìn)入不可逆的階段[16]，iNOS在心肌細(xì)胞缺血缺氧時(shí)表達(dá)顯著增加，促進(jìn)NO合成增加，心肌組織內(nèi)NO的高水平會(huì)通過激活MAPK通路、c-jun通路等多種凋亡通路誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡、影響心臟功能[17-18]，對(duì)心肌組織中caspase-3活性、iNOS的表達(dá)及NO水平的檢測(cè)，能反映心肌細(xì)胞的凋亡情況。研究表明，在傷后心肌組織內(nèi)caspase-3活性及iNOS、NO水平顯著升高，給予VPA治療后，caspase-3活性水平及iNOS、NO水平顯著降低，因此VPA能降低致死性燙傷大鼠心肌組織內(nèi)caspase-3活性及NO水平，抑制心肌細(xì)胞凋亡，保護(hù)心臟功能。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過VPA對(duì)50% TBSA Ⅲ度燙傷大鼠心臟功能及心肌細(xì)胞凋亡影響的研究，證實(shí)VPA能保護(hù)致死性燙傷大鼠心臟功能，降低心肌細(xì)胞凋亡率，其作用機(jī)制可能是通過降低心肌組織內(nèi)caspase-3活性、iNOS表達(dá)及NO水平，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)的。