納秒脈沖脈寬參數(shù)與細(xì)胞凋亡的量效關(guān)系研究*

張 玉，郭 飛

(1．重慶市中醫(yī)院婦科 400021；2.重慶郵電大學(xué)復(fù)雜系統(tǒng)與仿生控制重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 400065)

脈沖電場(chǎng)對(duì)細(xì)胞、組織及生物體的非熱電效應(yīng)已成為生物電磁學(xué)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1-2]。利用電場(chǎng)強(qiáng)度kV/cm、脈寬毫微秒級(jí)的電場(chǎng)脈沖作用于生物細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增加，使常態(tài)下無法透過細(xì)胞膜的物質(zhì)(如DNA、藥物分子等)順利進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的現(xiàn)象稱為電穿孔效應(yīng)。根據(jù)穿孔后細(xì)胞膜能否恢復(fù)常態(tài)，將電穿孔分為可逆電穿孔和不可逆電穿孔[3-4]。目前，可逆電穿孔效應(yīng)已成功應(yīng)用于基因轉(zhuǎn)染、藥物導(dǎo)入、細(xì)胞融合等領(lǐng)域，并由此產(chǎn)生電化學(xué)療法、電基因轉(zhuǎn)染等新型方法[5-6]。與可逆電穿孔治療腫瘤比較，不可逆電穿孔可獨(dú)立殺滅腫瘤細(xì)胞，而不需要化療藥物輔助，避免了化療藥物的毒副作用[7-8]，已成功應(yīng)用于腎癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌等實(shí)體腫瘤的治療，展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景[9-11]。

隨著研究的不斷深入，研究者發(fā)現(xiàn)當(dāng)脈沖電場(chǎng)脈寬降低至納秒級(jí)，電場(chǎng)強(qiáng)度增至數(shù)十kV/cm(納秒脈沖)時(shí)可以在細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜上產(chǎn)生更多、尺寸更小的微孔，使得更多小分子物質(zhì)能夠順利通過細(xì)胞膜或細(xì)胞器膜，該現(xiàn)象稱之為超級(jí)電穿孔[12-13]。利用納秒脈沖誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生超級(jí)電穿孔，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并激發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)的原理，在腫瘤治療中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[14-17]。目前在離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，采用的典型納秒脈沖參數(shù)為脈寬10～600 ns、電場(chǎng)強(qiáng)度20～100 kV/cm、頻率1～10 Hz的方波脈沖[18-19]。研究者多通過經(jīng)驗(yàn)或者文獻(xiàn)來選擇納秒脈沖參數(shù)，導(dǎo)致在研究中難以獲得理想的效果。目前，納秒脈沖參數(shù)與細(xì)胞生物電效應(yīng)之間的量效關(guān)系研究仍較匱乏，本文試圖從脈寬角度研究二者間的關(guān)系。本文選擇3組總能量相同、但脈寬不同的納秒脈沖作用于SKOV3細(xì)胞，通過實(shí)驗(yàn)和仿真計(jì)算來研究脈寬參數(shù)與細(xì)胞凋亡間的量效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及試劑

SKOV3細(xì)胞株(重慶醫(yī)科大學(xué)超聲工程研究所惠贈(zèng))；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、PBS、胰蛋白酶(美國Hyclon公司)；Annexin-V異硫氰熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)試劑盒(北京寶賽生物技術(shù)有限公司)；TMRM/JC-1探針試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)。

1.2 主要儀器

納秒脈沖源、電極小室(重慶市復(fù)雜系統(tǒng)與仿生控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室研制，型號(hào)NSPG-10K)；示波器(美國Tektronix TDS3032B)；激光掃描共聚焦顯微鏡 (德國Leica TCS-SP2)；流式細(xì)胞儀(美國FACS Calibur)；CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)。納秒脈沖源輸出脈沖參數(shù)：電壓10 kV，脈寬50～200 ns，頻率1～10 kHz。有關(guān)該脈沖源的原理及其輸出波形詳見文獻(xiàn)[20]。電極小室：間距為2 mm，當(dāng)脈沖源輸出電壓分別為1.4、2.0、2.8 kV時(shí)，將依次在電極小室中形成強(qiáng)度為7、10、14 kV/cm 的均勻脈沖電場(chǎng)(分別對(duì)應(yīng)脈寬50、100、200 ns)，將細(xì)胞懸液置于其中即可完成脈沖處理。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng)

復(fù)蘇SKOV3細(xì)胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMl-l640培養(yǎng)液內(nèi)，于37 ℃、5% CO2飽和溫濕度箱中培養(yǎng)，隔天換液，2～3 d進(jìn)行傳代。細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)給予0.25%胰蛋白酶消化1～2 min，收集細(xì)胞于離心管中，臺(tái)式離心機(jī)以1 000 r/min離心5 min，棄上清液，制成單細(xì)胞懸液，于血球計(jì)數(shù)板上作細(xì)胞計(jì)數(shù)，校正細(xì)胞懸液濃度至2×106/mL備用。

1.3.2Annexin-V/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

按照FITC標(biāo)記Annexin V細(xì)胞凋亡試劑盒的說明書操作，收集對(duì)照組及處理組(納秒脈沖處理后孵育6 h)細(xì)胞各1×106個(gè)，PBS洗滌2遍后，用250 μL Annexin V結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加5 μL Annexin V FITC和10 μL PI，混勻后室溫避光孵育15 min，在反應(yīng)管中加入400 μL PBS，立即用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以Annxin V+/PI-判斷為早期凋亡，Annxin V+/PI+判斷為晚期凋亡或壞死，Annxin V-/PI+判斷為操作中損傷細(xì)胞或處理過于強(qiáng)烈機(jī)械性損傷的細(xì)胞，Annxin V-/PI-判斷為正常細(xì)胞。

1.3.3激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞膜及線粒體膜電位

分別以TMRM和JC-1探針標(biāo)記細(xì)胞膜及線粒體膜，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。收集對(duì)照組(未用任何處理)及處理組(納脈沖處理后孵育6 h)細(xì)胞懸液并分別加入TMRM和JC-1染色液，37 ℃孵育15 min后PBS洗滌細(xì)胞兩次并加入少量PBS，采用激光共聚焦掃描顯微鏡實(shí)時(shí)觀測(cè)并記錄細(xì)胞膜及細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位熒光變化情況。

1.3.4膜電位、微孔密度及電導(dǎo)率仿真研究

參考文獻(xiàn)[21]，基于球形細(xì)胞五層介電模型，同時(shí)引入電穿孔效應(yīng)和細(xì)胞組分頻率色散效應(yīng)，進(jìn)而記錄細(xì)胞膜電導(dǎo)率及介電常數(shù)的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)變化，來獲取膜電位、微孔密度及電導(dǎo)率動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 不同脈寬參數(shù)下細(xì)胞凋亡率和壞死率

經(jīng)納秒脈沖處理后處理組各亞組(50、100、200 ns)細(xì)胞凋亡率和壞死率較對(duì)照組增加，且處理組各亞組間存在較大差異，100 ns脈沖組誘導(dǎo)最高的凋亡率(32.14±3.76)%，200 ns脈沖組誘導(dǎo)最高的壞死率(24.78±2.36)%。

A:凋亡率；B:壞死率；a：P<0.05,b：P<0.01，與對(duì)照組比較。

2.2 激光共聚焦檢測(cè)細(xì)胞膜和線粒體跨膜電位

50 ns脈沖處理后細(xì)胞膜跨膜電位與處理前比較具有一定程度的下降 (P<0.05)，100 ns脈沖處理后細(xì)胞膜跨膜電位下降更明顯(P<0.01)，200 ns脈沖處理后，熒光強(qiáng)度值下降最多(P<0.01)。見圖2。不同脈寬的納秒脈沖處理后，線粒體膜電位均出現(xiàn)不同程度的下降，且與脈沖寬度存在一定的關(guān)聯(lián)。其中，200 ns脈沖處理組熒光強(qiáng)度值較處理前明顯降低(P<0.05)，100 ns脈沖處理組線粒體跨膜熒光強(qiáng)度值下降更加明顯(P<0.01)，50 ns脈沖處理后線粒體跨膜熒光強(qiáng)度值下降最明顯(P<0.01)。見圖3。

A:熒光圖；B：熒光強(qiáng)度分析；a：P<0.05,b：P<0.01,與對(duì)照組比較。

A:激光共聚焦；B：熒光強(qiáng)度分析；a：P<0.05,b：P<0.01,與對(duì)照組比較。

2.3 跨膜電位、微孔密度及電導(dǎo)率的仿真結(jié)果

仿真計(jì)算基于球形細(xì)胞五層介電模型，考慮引入電穿孔Smoluchowski方程和頻率色散Debye方程，最終通過求解電磁場(chǎng)Laplace方程得出結(jié)果。本文仿真計(jì)算了上述納秒脈沖參數(shù)作用下球形細(xì)胞跨膜電位、微孔密度及電導(dǎo)率的變化規(guī)律。50 ns脈沖作用時(shí)細(xì)胞膜跨膜電位上升最快，且在12 ns達(dá)到其峰值1.15 V，隨后開始下降至平穩(wěn)值約1.05 V，最終隨外加脈沖下降而減小；100 ns和200 ns脈沖作用時(shí)細(xì)胞膜跨膜電位呈現(xiàn)類似的變化規(guī)律，但達(dá)到峰值時(shí)間依次增加且峰值及平穩(wěn)值依次增大，這是由于50 ns脈沖作用時(shí)細(xì)胞膜微孔密度及細(xì)胞膜電導(dǎo)率增加最為明顯，進(jìn)而導(dǎo)致穿孔后較低的跨膜電位平穩(wěn)值。50 ns脈沖作用時(shí)細(xì)胞器膜跨膜電位增加最為明顯，且隨著脈寬的增加，膜電位上升速度明顯變緩，見圖4。整體來看，隨著脈寬的增加，外加納秒脈沖對(duì)細(xì)胞膜的影響逐漸增強(qiáng)，而對(duì)細(xì)胞器膜的影響不斷減弱，與前述細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。而50 ns脈沖作用時(shí)細(xì)胞膜上微孔密度最大且電導(dǎo)率最高，是由于此時(shí)發(fā)生明顯的超級(jí)電穿孔效應(yīng)，與以往研究[22]相符。

A:細(xì)胞膜跨膜電位；B：線粒體膜跨膜電位；C：微孔密度；D：細(xì)胞膜電導(dǎo)率。

3 討 論

脈沖電場(chǎng)作用致使細(xì)胞膜跨膜電位變化是電穿孔效應(yīng)產(chǎn)生的生物電學(xué)基礎(chǔ)，通常認(rèn)為當(dāng)細(xì)胞膜跨膜電位由靜息電位(約70 mV)上升為0.4～1.0 V時(shí)，細(xì)胞發(fā)生電穿孔效應(yīng)，進(jìn)而使細(xì)胞膜通透性、電導(dǎo)率急劇增加，最終導(dǎo)致細(xì)胞膜、細(xì)胞器膜跨膜電位崩潰產(chǎn)生一系列諸如凋亡、壞死的生物電效應(yīng)[23-24]。因此，跨膜電位的實(shí)時(shí)變化規(guī)律是電穿孔效應(yīng)研究的關(guān)鍵所在，然而受限于測(cè)量手段的精度和適應(yīng)性，目前難以獲得脈沖電場(chǎng)作用時(shí)細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜跨膜電位的實(shí)時(shí)變化規(guī)律。實(shí)際上，研究者一般通過檢測(cè)脈沖作用前后的膜電位或者通過仿真計(jì)算脈沖作用時(shí)膜電位的變化規(guī)律來間接研究電穿孔效應(yīng)[25-26]。本文以膜電位變化為紐帶，分別從實(shí)驗(yàn)和仿真角度研究了細(xì)胞膜和線粒體膜電位變化規(guī)律，并對(duì)不同脈寬參數(shù)下的結(jié)果進(jìn)行分析，最終與實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞宏觀生物醫(yī)學(xué)效應(yīng)建立聯(lián)系，從而獲得納秒脈沖脈寬參數(shù)與細(xì)胞凋亡效應(yīng)之間的關(guān)系規(guī)律。

本文選擇3組不同脈寬但能量相同的納秒脈沖進(jìn)行研究，主要基于以下兩點(diǎn)：(1) 以往仿真及實(shí)驗(yàn)研究表明[27]，當(dāng)脈沖電場(chǎng)脈寬由毫微秒級(jí)降為納秒級(jí)時(shí)，其作用靶點(diǎn)將由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)至胞內(nèi)細(xì)胞器，對(duì)于納秒脈沖來說，隨著脈寬降低其作用靶點(diǎn)將逐漸由細(xì)胞膜轉(zhuǎn)至細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的規(guī)律依然存在，因此筆者選擇脈寬參數(shù)來進(jìn)行量效關(guān)系研究；(2) 選擇不同脈寬參數(shù)，但為了得到可以比較的結(jié)果，需保持3組脈沖能量相同，在脈沖個(gè)數(shù)一定的情況，通過設(shè)置不同脈沖場(chǎng)強(qiáng)來實(shí)現(xiàn)。

細(xì)胞典型的凋亡途徑包括死亡受體途徑和線粒體凋亡途徑[28]，二者分別與細(xì)胞膜和線粒體膜的跨膜電位改變密切相關(guān)，即納秒脈沖作用不同靶點(diǎn)將誘導(dǎo)對(duì)應(yīng)的凋亡途徑。本文的實(shí)驗(yàn)和仿真結(jié)果均表明，隨著脈寬降低，納秒脈沖作用靶點(diǎn)由細(xì)胞膜逐漸轉(zhuǎn)移至細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器；對(duì)于100 ns脈沖來說，其將同時(shí)有效作用于細(xì)胞膜和線粒體膜，從而誘導(dǎo)最大的凋亡效應(yīng)。而50 ns和200 ns誘導(dǎo)較低凋亡率的一個(gè)可能原因是：前者只靶向細(xì)胞器膜從而介導(dǎo)線粒體凋亡途徑，后者只介導(dǎo)死亡受體途徑，從而產(chǎn)生較低的細(xì)胞凋亡率。這只是本文給出的一個(gè)猜想，至于不同脈寬納秒脈沖是否介導(dǎo)不同途徑的細(xì)胞凋亡，仍需進(jìn)一步深入研究。

在仿真計(jì)算中發(fā)現(xiàn)50 ns脈沖作用產(chǎn)生最大的微孔密度，從而使得細(xì)胞膜電導(dǎo)率變化最大，這也與以往研究中隨脈寬降低微孔數(shù)量不斷增加相吻合[22]；由于本文仿真研究中未考慮微孔孔徑變化，實(shí)際上50 ns脈沖作用產(chǎn)生的微孔孔徑比較小，不能有效介導(dǎo)死亡受體凋亡途徑。

本研究只是對(duì)脈寬這一參數(shù)進(jìn)行了量效關(guān)系研究，實(shí)際上納秒脈沖參數(shù)包括場(chǎng)強(qiáng)、脈寬、頻率及脈沖個(gè)數(shù)等，另外對(duì)于不同的細(xì)胞類型及狀態(tài)，相應(yīng)的量效關(guān)系是否發(fā)生改變及如何變化仍需要進(jìn)一步深入研究。脈沖參數(shù)發(fā)生變化除了帶來細(xì)胞效應(yīng)的改變外，有可能引發(fā)新的生物電效應(yīng)[29]，如PAKHOMOVA等[30]發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在分串納秒脈沖處理后表現(xiàn)出超級(jí)敏感性，都是值得深入研究的內(nèi)容。在本文的仿真計(jì)算中采用的細(xì)胞幾何參數(shù)和電磁參數(shù)均來自以往文獻(xiàn)，與實(shí)驗(yàn)中SKOV3細(xì)胞實(shí)際參數(shù)存在較大差別，導(dǎo)致二者在比對(duì)時(shí)出現(xiàn)差異。

綜上所述，本文從脈寬參數(shù)角度研究納秒脈沖參數(shù)與細(xì)胞生物電效應(yīng)間的量效關(guān)系，能夠在一定程度上為納秒脈沖樣機(jī)研制及后續(xù)臨床前實(shí)驗(yàn)提供重要的理論依據(jù)和參數(shù)指導(dǎo)，具有重要的工程價(jià)值。

本文通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和仿真計(jì)算研究了納秒脈沖脈寬參數(shù)與細(xì)胞凋亡之間的量效關(guān)系，實(shí)驗(yàn)結(jié)果和仿真結(jié)論均表明二者之間存在一定的窗口效應(yīng)，即某一特定脈寬的脈沖(100 ns)同時(shí)靶向細(xì)胞膜和細(xì)胞器膜，可能通過死亡受體和線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞最大程度凋亡，且伴隨較小的細(xì)胞壞死率，這在臨床腫瘤治療中具有重要的意義。本研究結(jié)果能夠?yàn)榕R床樣機(jī)研制及后續(xù)臨床實(shí)驗(yàn)提供重要的理論支撐和參數(shù)指導(dǎo)。