闞 桐,王 越,王瑞剛
腦梗死發(fā)病率與死亡率逐年上升,氧化應(yīng)激、神經(jīng)細(xì)胞凋亡率增加是誘導(dǎo)腦梗死發(fā)生的重要原因[1-2]。氧糖剝奪/復(fù)氧損傷(OGD/R)誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞可作為探究腦缺血再灌注損傷的模型[3]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(Epigalocatechin gallate,EGCG)屬于綠茶茶多酚的主要成分,EGCG具有抗氧化、抗心肌缺血再灌注損傷的作用[4]。長鏈非編碼RNA MALAT1(Long non-coding RNA MALAT1,lncRNA MALAT1)可通過上調(diào)miR-146a的表達(dá)抑制MALAT1的表達(dá),從而抑制炎癥反應(yīng)[5]。生物信息學(xué)分析顯示,微小RNA-2115-3p (microRNA-2115-3p,miR-2115-3p)可能是MALAT1的靶基因,2型糖尿病伴嚴(yán)重肢體缺血的患者中miR-2115-3p上調(diào)[6]。本研究采用OGD/R處理神經(jīng)細(xì)胞建立細(xì)胞損傷模型,探討EGCG對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激的影響及其作用機(jī)制。
1.1 材料與試劑 EGCG購自大連美侖生物技術(shù)有限公司(批號:MB1672,純度:95%);大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞HT22(上海聯(lián)邁生物工程有限公司);杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、Opti-MEM血清培養(yǎng)基購自美國Gibco公司;Trizol試劑與Lipofectamine2000購自美國Invitrogen公司;反轉(zhuǎn)錄與實時熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司;miR-2115-3p寡核苷酸模擬物(miR-2115-3p mimics)及陰性對照mimic NC序列(miR-NC)、MALAT1小分子干擾RNA(si-MALAT1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司;pcDNA3.1購自上海索寶生物科技有限公司;超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialedhyde,MDA)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-異硫氰酸熒光素(FITC)/碘化丙啶(PI)細(xì)胞凋亡試劑盒購自美國Sigma公司;RIPA裂解液購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;兔抗鼠B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)、B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)抗體購自美國CST公司;辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的培養(yǎng)基,待細(xì)胞生長至80%融合度時,使用0.25%胰蛋白酶消化,加入DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞密度為3×104個/ml,按照每孔150 μl的密度將細(xì)胞接種于96孔板,分別進(jìn)行氧糖剝奪4 h處理,隨后更換DMEM完全培養(yǎng)基復(fù)氧處理24 h[7],將進(jìn)行氧糖剝奪/復(fù)氧損傷(OGD/R)的細(xì)胞作為OGD/R組。同時將正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為Con組。分別使用不同濃度(25、50、100 μmol/L)的EGCG處理神經(jīng)細(xì)胞24 h[8],隨后進(jìn)行OGD/R處理,分別記作EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組。將培養(yǎng)基更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基,參照Lipofectamine2000試劑盒說明書分別將pcDNA、pcDNA-MALAT1轉(zhuǎn)染至神經(jīng)細(xì)胞,轉(zhuǎn)染6 h后將培養(yǎng)基更換為DMEM完全培養(yǎng)基,使用濃度為100 μmol/L的EGCG處理24 h,隨后進(jìn)行OGD/R處理,分別記作EGCG-H+pcDNA組、EGCG-H+pcDNA-MALAT1組。
1.2.2 檢測SOD、MDA含量 收集各組細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗滌,4 ℃條件下經(jīng)3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min,取上清,參照試劑盒說明書分別檢測SOD、MDA的含量,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。
1.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率 取各組對數(shù)生長期神經(jīng)細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗滌,4 ℃條件下經(jīng)3 000 r/min轉(zhuǎn)速離心6 min,相同條件下使用PBS洗滌3次,棄上清,收集細(xì)胞沉淀,加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞,依次分別加入5 μl Annexin V-FITC與5 μl PI,室溫振蕩孵育10 min,應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡率。
1.2.4 實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)檢測細(xì)胞中MALAT1、miR-2115-3p的表達(dá)水平 取各組對數(shù)生長期神經(jīng)細(xì)胞,采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA,應(yīng)用Nanodrop2000c超微量分光光度計檢測RNA濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將總RNA合成cDNA。MALAT1正向引物5′-CCCCTGGGCTTCTCTTAACA-3′,反向引物5′-TAGATCAAAAGGCACG GGGT-3′;miR-2115-3p正向引物5′-TTGTCCTTCATTCCACCGGA-3′,反向引物5′-TACAT GTTCCCACCCAGCAT-3′;GAPDH正向引物5′-AACGGATTTGGTCGTATTG-3′,反向引物5′-GGAAGATGGTGATGGGATT-3′;U6正向引物5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′,反向引物5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′,引物由上海生工生物工程股份有限公司設(shè)計合成。參照實時熒光定量PCR試劑盒配置反應(yīng)體系,反應(yīng)條件:95 ℃ 2 min,95 ℃ 30 s,59 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共40次循環(huán)。MALAT1以GAPDH為內(nèi)參,miR-2115-3p以U6為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算MALAT1、miR-2115-3p相對表達(dá)量。
1.2.5 雙熒光素酶報告基因檢測MALAT1的靶基因 starBase預(yù)測顯示MALAT1與miR-2115-3p存在結(jié)合位點(diǎn),由此推測MALAT1可能靶向調(diào)控miR-2115-3p,利用基因突變技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變,分別將含有結(jié)合位點(diǎn)與突變位點(diǎn)的序列插入熒光素酶報告基因載體分別構(gòu)建野生型載體WT-MALAT1、突變型載體MUT-MALAT1。分別將miR-NC、miR-2115-3p mimics與WT-MALAT1、MUT-MALAT1共轉(zhuǎn)染至神經(jīng)細(xì)胞,檢測各組細(xì)胞相對熒光素酶活性。分別將pcDNA、pcDNA-MALAT1、si-NC、si-MALAT1轉(zhuǎn)染至神經(jīng)細(xì)胞,采用qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中miR-2115-3p的表達(dá)水平。
1.2.6 蛋白免疫印跡(Western blot)檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá) 收集各組對數(shù)生長期神經(jīng)細(xì)胞,加入400 μl RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白,采用BCA法檢測蛋白濃度,蛋白變性,采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,轉(zhuǎn)膜,封閉,分別加入Bax (1∶1 000)、Bcl-2 (1∶1 000)與內(nèi)參蛋白GAPDH (1∶1 000)一抗稀釋液,4 ℃孵育24 h,TBST洗滌,加入二抗稀釋液(1∶2 000),室溫孵育1 h,TBST洗滌,滴加ECL,顯影,應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。
2.1 EGCG對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響 與Con組比較,OGD/R組SOD含量降低(P<0.05),MDA含量升高(P<0.05);與OGD/R組比較,EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組SOD含量升高(P<0.05),MDA含量降低(P<0.05),且EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組間SOD、MDA含量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。
表1 EGCG對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響(n=9)
2.2 EGCG對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響 與Con組比較,OGD/R組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05),Bax蛋白水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05);與OGD/R組比較,EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05),Bax蛋白水平降低(P<0.05),Bcl-2蛋白水平升高(P<0.05),且EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組細(xì)胞凋亡率與Bax、Bcl-2蛋白水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見圖1、表2。
2.3 EGCG對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中MALAT1、miR-2115-3p表達(dá)量的影響 與Con組比較,OGD/R組細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)水平升高(P<0.05),miR-2115-3p的表達(dá)水平降低(P<0.05);與OGD/R組比較,EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)水平降低(P<0.05),miR-2115-3p的表達(dá)水平升高(P<0.05),且EGCG-L組、EGCG-M組、EGCG-H組間MALAT1、miR-2115-3p的表達(dá)水平比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表3。
圖1 EGCG對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響
表2 EGCG對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響(n=9)
2.4 MALAT1靶向調(diào)控miR-2115-3p starBase預(yù)測顯示,MALAT1的序列中含有與miR-2115-3p互補(bǔ)的核苷酸序列,見圖2。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示,共轉(zhuǎn)染野生型載體WT-MALAT1的細(xì)胞實驗中,與miR-NC組比較,miR-2115-3p組熒光素酶活性降低(P<0.05);共轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-MALAT1的細(xì)胞實驗中,miR-2115-3p組熒光素酶活性與miR-NC組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表4。與pcDNA組比較,pcDNA-MALAT1組細(xì)胞中miR-2115-3p表達(dá)降低(P<0.05);與si-NC組比較,si-MALAT1組細(xì)胞中miR-2115-3p的表達(dá)水平升高(P<0.05),見表5。
表3 EGCG對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中MALAT1、miR-2115-3p表達(dá)量的影響(n=9)
圖2 MALAT1的序列中含有與miR-2115-3p互補(bǔ)的核苷酸序列
表4 雙熒光素酶報告實驗(n=9)
表5 MALAT1靶向調(diào)控miR-2115-3p的表達(dá)(n=9)
2.5 MALAT1過表達(dá)降低EGCG對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的作用 與EGCG-H+pcDNA組比較,EGCG-H+pcDNA-MALAT1組細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05),Bax蛋白水平升高(P<0.05),Bcl-2蛋白水平降低(P<0.05),SOD含量降低(P<0.05),MDA含量升高(P<0.05),見圖3、表6。
圖3 MALAT1過表達(dá)降低EGCG對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用注:A.流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率,B.Western blot法檢測Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)
表6 MALAT1過表達(dá)降低EGCG對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的作用(n=9)
腦梗死患者腦部缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡率明顯升高,進(jìn)而導(dǎo)致腦功能損傷甚至死亡,已嚴(yán)重影響患者生命安全。既往研究顯示,人參皂苷、三七總皂苷、紅景天苷等中醫(yī)藥物對缺血再灌注損傷后神經(jīng)細(xì)胞凋亡等具有一定抑制作用[9-11]。但仍有部分中醫(yī)藥物在腦梗死治療過程中的作用機(jī)制尚未闡明。因此,本研究積極探尋新型缺血性腦部疾病治療藥物并探究其可能作用機(jī)制,為提高患者的治療效果提供新方向。
EGCG可通過抑制過氧化氫的生成及清除氧自由基等,對心肌缺血再灌注損傷發(fā)揮保護(hù)作用,還可通過抑制心肌細(xì)胞凋亡減緩心肌缺血再灌注損傷[12-13]。研究表明,EGCG在一定程度上可抑制神經(jīng)元凋亡,從而對繼發(fā)性脊髓損傷發(fā)揮保護(hù)作用[14]。但關(guān)于EGCG對缺血再灌注損傷誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制尚未完全闡明。氧化應(yīng)激主要是指機(jī)體氧化與抗氧化能力失衡,氧自由基的大量生成可促使腦缺血再灌注神經(jīng)細(xì)胞凋亡,抑制氧自由基的生成可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng),從而達(dá)到治療再灌注損傷的目的。研究表明,OGD/R可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞中活性氧的生成量增加,SOD可清除氧自由基,從而減弱缺血損傷導(dǎo)致的神經(jīng)細(xì)胞凋亡,而MDA屬于脂質(zhì)類過氧化物,并可促進(jìn)氧自由基的生成[15-17]。本研究結(jié)果顯示,OGD/R處理后,神經(jīng)細(xì)胞中SOD含量降低,MDA含量升高,提示OGD/R誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)、OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷模型建模成功。本研究采用不同濃度的EGCG處理后,OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中SOD含量升高,MDA含量降低,且隨著EGCG使用劑量的增加而顯著變化,提示EGCG可抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化損傷,且呈劑量依賴效應(yīng)。研究表明,Bcl-2屬于抗凋亡蛋白,Bax屬于促凋亡蛋白,Bax表達(dá)上調(diào)可促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素C而激活caspase級聯(lián)反應(yīng),從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。本研究結(jié)果顯示,OGD/R處理后,神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著升高,Bax表達(dá)上調(diào),Bcl-2表達(dá)下調(diào),而不同濃度的EGCG處理后,神經(jīng)細(xì)胞凋亡率顯著降低,Bax表達(dá)下調(diào),Bcl-2表達(dá)上調(diào),且呈劑量依賴效應(yīng)。提示EGCG可抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
MALAT1可通過促進(jìn)SAA3表達(dá)而增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的膿毒性心肌細(xì)胞炎癥反應(yīng)[19]。MALAT1通過調(diào)控miR-150-5p/NF-κB分子軸,在敗血癥誘發(fā)的心臟炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[20]。本研究結(jié)果顯示,OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞中MALAT1表達(dá)水平升高,miR-2115-3p的表達(dá)水平降低,而不同濃度的EGCG處理后神經(jīng)細(xì)胞中MALAT1的表達(dá)水平降低,miR-2115-3p的表達(dá)水平升高,且呈劑量依賴效應(yīng)。進(jìn)一步分析顯示,MALAT1可靶向結(jié)合miR-2115-3p,并可負(fù)向調(diào)控miR-2115-3p的表達(dá),提示EGCG可能通過下調(diào)MALAT1的表達(dá)及上調(diào)miR-2115-3p的表達(dá)從而減輕OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷。為驗證上述推測,本研究將MALAT1過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至神經(jīng)細(xì)胞,使用EGCG處理后進(jìn)行OGD/R處理,結(jié)果顯示,miR-2115-3p的表達(dá)水平降低,細(xì)胞凋亡率升高,Bax蛋白水平升高,Bcl-2蛋白水平降低,SOD含量降低,MDA含量升高,說明MALAT1過表達(dá)降低EGCG對OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡的作用。提示EGCG可通過調(diào)控MALAT1/miR-2115-3p分子軸,從而抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激及凋亡。
綜上所述,EGCG可抑制OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡及減輕細(xì)胞氧化損傷,其作用機(jī)制與調(diào)控MALAT1/miR-2115-3p分子軸有關(guān),可為缺血性腦疾病的治療提供新方向,還可為進(jìn)一步揭示EGCG在缺血性腦疾病治療中的作用機(jī)制提供實驗依據(jù)。