地塞米松改善膠原性關(guān)節(jié)炎大鼠免疫功能與其血藥濃度的相關(guān)性研究

許冰馨，王琪珊，范凱健，朱靜艷，王婷玉*

0 引言

類風濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種慢性、伴有侵襲性關(guān)節(jié)炎的自身免疫性疾病，主要癥狀為滑膜炎癥、骨和軟骨破壞。早期有關(guān)節(jié)疼痛腫脹、嚴重時會發(fā)生骨侵蝕、關(guān)節(jié)變形，甚至喪失功能[1]。目前已有生物制劑療法可以通過抑制炎性細胞因子和調(diào)節(jié)T、B淋巴細胞增生，從而顯著改善患者的生活質(zhì)量。然而，仍然有超過1/3的患者在忍受著關(guān)節(jié)炎癥和進行性關(guān)節(jié)損傷。最近的研究表明，在現(xiàn)有治療方案中輔助使用糖皮質(zhì)激素(Glucocorticoid，GCs)可以顯著提高臨床療效[2]。但由于GCs缺乏組織特異性，并伴有可能存在的全身性毒副作用，如高血糖、體重增加、免疫學功能降低等，這些都限制了其作為輔助療法的廣泛應用[3]。Wang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，地塞米松(Dexamethasone，DEX)可以減少關(guān)節(jié)腫脹、骨侵蝕，降低炎癥因子表達。Hajialilo等[5]發(fā)現(xiàn)，DEX不僅可以快速緩解臨床RA患者關(guān)節(jié)腫脹和疼痛，且作用是長期且安全有效的。地塞米松對RA的調(diào)節(jié)作用機制尚不明確。本文通過在Wistar大鼠上進行CIA模型的造模后，給予DEX(1 mg/kg)腹腔注射。通過觀察足趾腫脹、用藥后體重變化、HPLC法檢測血藥濃度、PCR法檢測脾淋巴細胞炎癥因子和Th亞型的特異性轉(zhuǎn)錄因子的水平，并對血藥濃度和臟器指數(shù)以及Th亞型的特異性轉(zhuǎn)錄因子做相關(guān)性分析，來驗證此劑量的地塞米松對類風濕關(guān)節(jié)炎免疫調(diào)節(jié)和全身炎癥的療效，以及免疫功能改善和DEX血藥濃度的相關(guān)性。

1 材料

1.1 動物 22只SPF清潔級Wistar大鼠，雄性，6～8周齡，體重(160±20) g。購買和飼養(yǎng)于上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院實驗動物中心。動物生產(chǎn)許可證編號為SCXK(滬)2013-0016，使用許可證編號為SYXK(滬)2016-0016。將動物隨機分成3組，在濕度為50%～60%，溫度(22±2)℃，明暗12 h交替的環(huán)境中適應至少1周。本實驗通過我院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 試劑 牛Ⅱ型膠原(Chondrex公司，批號：170606)、弗氏不完全佐劑(Chondrex公司，批號：170594)、地塞米松(Stemcell technologies，批號：BX27114)、紅細胞裂解液(SIGMA公司，批號：#RNBG8098)、甲醇溶液(永華化學科技有限公司，批號：20181224)。TRIzol(美國Ambion公司，批號：184608)。PCR引物(上海生工生物科技有限公司)、SYBR Green qPCR Master Mix(日本TaKaRa公司，批號：522072)。

1.3 儀器 旋渦混懸儀(海門其林貝爾，型號：VORTEX-5)、離心機(德國Beckman，型號Microfuge 20R)、電子天平(上海浦春計量有限公司，型號：JE2001)、高效液相色譜儀(Waters，型號：Alliance2489)。

2 方法

2.1 CIA造模方法 4 ℃冰浴條件下，將牛Ⅱ型膠原與弗氏不完全佐劑按1∶1混勻成乳劑，第0日，將乳劑環(huán)繞多點注射于大鼠尾根部，每只注射乳劑共0.1 ml。第7日，將相同乳劑以同樣方式注射于大鼠尾根部，每只注射0.1 ml。

2.2 實驗分組與給藥方法 32只雄性Wistar大鼠，除正常組10只外，其余22只大鼠又隨機平均分成模型組和給藥組各11只。第8日開始，給藥組腹腔注射地塞米松1 mg/kg，每周給藥3次，連續(xù)給藥4周。同時，正常組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水。每周2次測量并記錄各組大鼠體重變化。觀察大鼠站姿、行走步態(tài)、舔足現(xiàn)象等生存狀態(tài)。

2.3 臟器指數(shù)的測定[6]腹腔注射10%的水合氯醛(0.4 ml/100 g)麻醉后，稱體重、取出胸腺和脾臟并稱重。計算脾臟和胸腺指數(shù)。臟器指數(shù)=內(nèi)臟質(zhì)量(mg)/大鼠體重(g)。

2.4 HPLC法測定地塞米松血藥濃度 末次給藥24 h后，大鼠處死取血，經(jīng)離心得到血清。采用Diamonsil C18柱(5 μm)色譜柱分離，流動相為甲醇∶水(70∶30)，流速為1 ml/min，檢測波長為240 nm，進樣量60 μl。內(nèi)標液為地西泮的甲醇溶液(1 μg/ml)，標準品為地塞米松的甲醇溶液(5 μg/ml)。血清先用ZnSO4沉淀法預處理。A空白組：正常大鼠血清200 μl+內(nèi)標液10 μl；B標準品組：正常大鼠血清190 μl+標準品10 μl+內(nèi)標10 μl；C樣品組：給藥組大鼠血清200 μl+內(nèi)標10 μl。各組加入2.5% ZnSO440 μl。樣本經(jīng)過振蕩混勻，離心(14 000轉(zhuǎn)/min×10 min)，取上清液60 μl進樣。

2.5 Real-time PCR檢測脾臟淋巴細胞相關(guān)炎癥因子、轉(zhuǎn)錄因子的mRNA表達情況 各組大鼠脾臟經(jīng)剪碎、研磨、過濾、離心、紅細胞裂解液裂解后獲得脾臟淋巴細胞。再用TRIzol法提取脾淋巴細胞總RNA，并在PCR擴增儀逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。PCR擴增程序：95 ℃高溫變性，60 ℃低溫退火并延伸，共40個循環(huán)，65 ℃適溫延伸[7]。引物序列見表1。

表1 PCR引物序列

3 結(jié)果

3.1 地塞米松對CIA大鼠足趾腫脹和行動的影響 第15日開始，模型組的足爪從趾尖到踝關(guān)節(jié)逐漸出現(xiàn)發(fā)紅、腫脹、變形，最嚴重時站立、行動困難，并常伴舔足行為發(fā)生；地塞米松腹腔注射后的大鼠行動正常，少有舔足行為。足爪和踝關(guān)節(jié)發(fā)紅、腫脹現(xiàn)象明顯得到緩解，未出現(xiàn)關(guān)節(jié)變形。見圖1。

圖1 大鼠足爪腫脹情況(A.正常組，B.模型組，C.給藥組)

3.2 體重變化 CIA造模成功后，關(guān)節(jié)腫脹疼痛導致大鼠進食量下降，模型組體重較正常組快速下降(P<0.01)，直到造模后期，體重逐漸恢復上升趨勢。地塞米松抑制了CIA關(guān)節(jié)炎癥，給藥組無明顯下降趨勢。但由于地塞米松具有生長抑制的不良反應，給藥組體重始終維持在較低水平，造模后期逐漸緩慢上升。其中第12～18日為致炎初期，模型組關(guān)節(jié)炎癥顯著，給藥組體重與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖2。

圖2 地塞米松對大鼠體重的影響(n=10)

3.3 地塞米松對CIA大鼠脾臟和胸腺指數(shù)的影響 與正常組比較，模型組脾臟指數(shù)升高(P<0.01)、胸腺指數(shù)升高(P<0.05)；與模型組比較，給藥組脾臟、胸腺指數(shù)下降(P<0.01)，差異有統(tǒng)計學意義，見表2。CIA造模成功后，免疫紊亂導致脾臟和胸腺腫大。地塞米松具有免疫抑制作用，減輕了脾臟、胸腺的腫脹。

表2 地塞米松對脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的影響(n=10)

3.4 地塞米松對炎癥因子mRNA表達的影響 Real-time PCR結(jié)果可見，相較正常組，模型組脾淋巴細胞中的炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α mRNA的相對表達量上升；給藥組中這些炎癥因子的相對表達量較模型組減少，差異均具有統(tǒng)計學意義。表明地塞米松可以抑制炎癥因子，具有抗炎作用。見圖3A。

3.5 地塞米松對T淋巴細胞亞群特異性轉(zhuǎn)錄因子的影響 Real-time PCR結(jié)果可見，模型組脾淋巴細胞中Th1、Th17的特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、RORγT的mRNA相對表達量較正常組上升，Th2、Treg轉(zhuǎn)錄因子GATA3、Foxp3的mRNA表達較正常組下降；給藥組T-bet、RORγT的mRNA相對表達量較模型組下降，GATA3、Foxp3的mRNA表達較模型組上升，差異均具有統(tǒng)計學意義。見圖3B。

T-bet/GATA3的比值：模型組(2.484±0.765)較正常組(0.597±0.134)升高(P<0.05)，而給藥后比值(0.760±0.153)比模型組低(P<0.05)。RORγT/Foxp3的比值：模型組(6.864±2.473)較正常組(0.346±0.200)高(P<0.05)。給藥組比值(0.239±0.061)較模型組降低(P<0.01)。

圖3 脾淋巴細胞PCR結(jié)果(n=3)

3.6 血藥濃度與T淋巴細胞亞群特異性轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)性分析 地塞米松出峰時間約為6 min，內(nèi)標出峰時間約為9 min(見圖4)。通過計算地塞米松和內(nèi)標的峰面積比值，求得末次給藥24 h后，給藥組血清地塞米松濃度為0.173 8 μg/ml。分別將血藥濃度與脾臟指數(shù)、轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、RORγT、Foxp3的mRNA水平和進行相關(guān)性分析。血藥濃度與脾臟指數(shù)相關(guān)系數(shù)為-0.986 96，呈負相關(guān)。血藥濃度與轉(zhuǎn)錄因子T-bet的相關(guān)性為-0.982 7，呈負相關(guān)；與GATA3的相關(guān)性為0.997 5，呈正相關(guān)；與RORγT的相關(guān)性為-0.902 1，呈負相關(guān)；與Foxp3的相關(guān)性為0.968 3，呈正相關(guān)(見圖5)。給藥后，血藥濃度高的大鼠脾臟指數(shù)較低；脾淋巴細胞中T-bet、RORγT表達越低，GATA3、Foxp3表達越高。

圖4 地塞米松血藥濃度HPLC色譜圖

圖5 地塞米松血藥濃度與脾臟系數(shù)、T淋巴細胞亞群特異性轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)性

4 討論

類風濕關(guān)節(jié)炎是一種慢性T細胞介導為主的自身免疫性疾病，給患者的生活帶來了極大的影響[8]。臨床研究顯示，部分類風濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)變形嚴重并深受疼痛的折磨[9]。CIA和RA類似，同為自身免疫耐受破壞，產(chǎn)生自身抗體，并都有關(guān)節(jié)腫脹變形、滑膜炎、骨和軟骨破壞。由于CIA與RA相似，且造模穩(wěn)定性高，故本實驗選此動物模型進行研究。地塞米松是強效的糖皮質(zhì)激素，具有抗炎、抗風濕、免疫抑制作用[10]。它能減輕組織的炎癥反應、緩解關(guān)節(jié)腫脹、減少巨噬細胞聚集，還能抑制T淋巴細胞介導的免疫反應，從而控制炎癥因子的生成與釋放[11-12]。地塞米松治療類風濕關(guān)節(jié)炎的作用機制和安全有效的藥物濃度范圍尚不明確，若長期大劑量使用會造成不良反應。因此，本研究對地塞米松治療CIA大鼠炎癥和免疫改善作用的機制進行深入研究，通過觀察該血藥濃度下的治療效果，證實該血藥濃度下地塞米松的有效性，并為找尋合理、安全的給藥劑量提供參考依據(jù)。

脾臟和胸腺是人體兩大免疫器官。胸腺是中樞免疫器官，脾臟是外周免疫器官。脾臟作為人體最大免疫器官，富含大量淋巴細胞和巨噬細胞，是免疫應答的重要場所。研究顯示，模型組出現(xiàn)脾臟和胸腺腫大，而地塞米松組胸腺和脾臟腫大較模型均有緩解，說明地塞米松能緩解CIA的免疫器官腫大，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。

IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α在RA患者體內(nèi)大量存在，是造成滑膜炎、關(guān)節(jié)腫脹軟骨破壞和疼痛的重要因素，且炎癥因子在體內(nèi)的含量高低決定RA的嚴重程度[13-15]。PCR法檢測大鼠脾臟淋巴細胞中的炎癥因子IL-1β、IL-6、IL-17、TNF-α后發(fā)現(xiàn)，模型組炎癥因子mRNA表達水平均高于正常組，而給藥組的炎癥因子水平較模型組均降低，說明地塞米松不但能緩解局部的關(guān)節(jié)腫脹，而且還具有整體的炎癥抑制作用。

臨床研究證實，RA患者Th1/Th2和Th17/Treg失衡，比值升高，可能是導致RA的重要原因[16-17]，故調(diào)節(jié)Th1/Th2和Th17/Treg失衡狀態(tài)有利于治療RA。特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、RORγT、Foxp3相互調(diào)節(jié)和抑制，其水平分別決定Th1、Th2、Th17和Treg細胞的活化程度，以及機體免疫調(diào)節(jié)功能的水平。脾臟是體液免疫和細胞免疫的重要場所，故本實驗通過PCR方法檢測大鼠脾淋巴細胞中轉(zhuǎn)錄因子T-bet、GATA3、RORγT、Foxp3 mRNA相對表達量并計算其比值。PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組T-bet、RORγT 的表達量高于正常組；GATA3、Foxp3低于正常組。給藥后GATA3、Foxp3表達升高，而T-bet、RORγT表達降低。模型組脾淋巴細胞中T-bet/GATA3比值和RORγT/Foxp3比值較正常組升高，給予地塞米松治療后均降低，說明地塞米松可能通過抑制大鼠T細胞向Th1和Th17分化，減少T-bet和RORγT轉(zhuǎn)錄，增加GATA3和Foxp3的轉(zhuǎn)錄來調(diào)整Th1/Th2失衡、改善Th17/Treg比例，最終調(diào)整CIA免疫應答失衡狀態(tài)。

血液中外源性糖皮質(zhì)激素的水平高低與免疫抑制作用有關(guān)。地塞米松血漿半衰期為190 min，是一類抗炎作用強大的長效制劑，但長期使用可產(chǎn)生生長抑制等不良反應。因此，控制安全的血藥濃度范圍，對提高藥效、降低副作用有重要意義。盡管已有針對男女性別間GCs的藥代動力學/藥效學(PK/PD)的差異研究，但尚未對CIA大鼠的血藥濃度進行這種全面的評估。本實驗通過HPLC法測得的血藥濃度，并與脾臟系數(shù)、T淋巴細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子做相關(guān)性分析，結(jié)果表明，DEX血藥濃度與脾臟指數(shù)的相關(guān)系數(shù)為-0.986 96，呈負相關(guān)；與T淋巴細胞亞群特異性轉(zhuǎn)錄因子T-bet的相關(guān)系數(shù)為-0.982 7，呈負相關(guān)；與GATA3的相關(guān)系數(shù)為0.997 5，呈正相關(guān)；與RORγT的相關(guān)系數(shù)為-0.902 1，呈負相關(guān)；與Foxp3的相關(guān)系數(shù)為0.968 3，呈正相關(guān)。在0.101～0.314 μg/ml的血藥濃度范圍內(nèi)，大鼠足趾基本完全消除腫脹，免疫器官腫脹得到改善，脾淋巴細胞中炎癥因子減少，Th1/Th2和Th17/Treg失衡改善，T淋巴細胞亞群特異性轉(zhuǎn)錄因子水平逐漸恢復正常。實驗過程未出現(xiàn)顯著的體重抑制和明顯毒副作用，且無動物死亡。鑒于良好的治療效果和較少的不良反應，推測地塞米松血藥濃度是安全的，且應該在臨床有效治療濃度范圍內(nèi)。臨床應用時，還可以考慮使用緩釋制劑或采用局部給藥，以減少藥物導致的不良反應，并提高依從性。

綜上所述，地塞米松能抑制關(guān)節(jié)炎癥、足跖腫脹，預防關(guān)節(jié)變形。用藥后除緩解關(guān)節(jié)腫脹外，地塞米松還能抑制脾臟T淋巴細胞中促炎因子的形成，降低體整體炎癥因子水平；同時具有調(diào)節(jié)免疫的作用，可有效糾正Th1/Th2、Th17/Treg失衡的狀態(tài)，可見地塞米松對CIA的關(guān)節(jié)炎癥和免疫失衡有著積極的治療作用。