3 個耐寒桑品種不同部位的1-脫氧野尻霉素（DNJ）含量分布

王彬彬，賈漫麗，范偉，李季生，楊貴明，李娜，楊曉東

（河北省高校特產(chǎn)蠶桑應用技術研發(fā)中心/承德醫(yī)學院蠶業(yè)研究所，河北 承德 067000）

我國的栽桑養(yǎng)蠶歷史迄今已超過6 000 a，有近百萬公頃的桑園，桑資源極其豐富。桑樹主要含有蛋白質(zhì)、糖、脂肪、多酚、生物堿等物質(zhì)[1]，其中1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ） 是桑樹中一種獨有的生物堿，化學名為 （2R，3R，4R，5S） -2-（羥甲基）-3，4，5-三羥基哌啶，分子式為C6H13NO4，相對分子質(zhì)量為163[2]。DNJ 是一種α-葡萄糖甘酶抑制劑，具有降血糖、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物活性[3～7]。

DNJ 分布在為數(shù)不多的幾種植物（桑樹、風信子、鴨跖草、桔梗科沙屬植物等）、部分微生物（淺灰鏈霉菌、芽孢桿菌等）和昆蟲（家蠶、桑蟥、桑螟等）中[8]，而桑樹是DNJ 已知來源中含量最高的一種，DNJ 是桑樹區(qū)別于其他藥用植物最具有特色和代表性的次生代謝產(chǎn)物。因此，近年來國內(nèi)外學者對桑樹中的DNJ 分布和含量變化進行了廣泛研究，發(fā)現(xiàn)桑樹的各個部位均含有DNJ，以葉片中含量最多，但其含量易受到桑樹品種[9，10]、產(chǎn)地[11]、采摘時期[12，13]和部位[14，15]的影響而出現(xiàn)較大差別。此外，桑葉中的DNJ 含量還受葉位[16]、發(fā)育階段[13]、采收時間[17]和季節(jié)[18]的影響。然而，從研究的地域和桑樹性狀來看，北方抗寒桑樹品種DNJ 含量的研究還相對較少。以往研究表明桑樹品種間DNJ 含量存在有較大差異，加上南方桑樹品種很難在北方越冬，所以無法給北方地區(qū)開發(fā)桑樹藥用價值提供較好的樹種和原料。在北方冬季低溫持續(xù)期長，初冬溫度驟然下降，早春溫度急變以及解凍與復凍持續(xù)交替出現(xiàn)，導致桑樹發(fā)生不同程度的凍害。調(diào)查結(jié)果顯示，桲欏、冀桑2 號和國桑21 號是北方地區(qū) 3 個耐寒性好的主栽桑樹品種[19，20]。

以北方3 個耐寒桑品種國桑21 號、冀桑2 號和桲欏為研究對象，對枝葉不同部位的DNJ 含量進行測定，以期明確DNJ 在桑樹各部位中的消長規(guī)律，為北方寒冷地區(qū)更有效地開發(fā)桑DNJ 資源提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 桑樹材料 試驗桑樹品種為北方地區(qū)3 個耐寒桑品種國桑21 號、冀桑2 號和桲欏，均種植于承德醫(yī)學院蠶業(yè)研究所種質(zhì)資源圃。采樣桑樹均于2010年栽植，株行距100 cm×200 cm；2018 年4 月進行春伐，8 月25 日選擇桑樹葉片和枝皮進行DNJ 含量測定。

1.1.1.1 不同葉位的桑葉樣品。按田間分布五點采樣法，在冀桑2 號和國桑21 號上分別采摘1～4、5～10、11～16、17～25、26～39、40～60 葉位的桑葉，在桲欏上采摘 1～4、5～10、11～16、17～25、26～39 葉位的桑葉，每個采樣點各葉位均采摘桑葉20 片。將相同葉位的桑葉樣品混合，冷凍干燥后粉碎，過60 目篩，-20 ℃保存，備用。

1.1.1.2 枝條不同部位的桑皮樣品。按田間分布五點采樣法，在冀桑2 號和桲欏上，分別選取當年生中部枝條的上、中、下3 個部位，每個采樣點各部位均選取20 cm 長的枝條樣品10 個，剝?nèi)⌒迈r桑皮。將相同部位的樣品混合，冷凍干燥后粉碎，過60 目篩，-20 ℃保存，備用。

1.1.1.3 桑葉上不同部位的樣品。按田間分布五點采樣法，在冀桑2 號中部枝條上采摘完整的葉片10 片，將完整葉片分為葉片（無葉脈）、葉脈和葉柄三部分。將相同部位的新鮮樣品混合，冷凍干燥后粉碎，過60目篩，-20 ℃保存，備用。

1.1.2 試劑 1-DNJ 標準品（純度≥98%）和9-芴甲氧羰酰氯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC-Cl，純度≥99.1%），購自美國Sigma 公司；色譜純乙腈和甲醇，購自上海阿拉丁生化科技有限公司；甘氨酸（Gly）、醋酸、濃鹽酸等其他試劑均為分析純，國產(chǎn)；HPLC 用水均為雙蒸水。

1.1.3 儀器 試驗儀器有島津LC-2030 高效液相色譜系統(tǒng)（日本）、Lab solutions 色譜處理工作站、KS-300EⅡ型超聲波清洗機（寧波海曙科生超聲設備有限公司）、OHAUS AR224CN 分析天平（奧豪斯儀器有限公司） 和VELOCITY 18R 臺式冷凍高速離心機（Dynamica）。

1.2 試驗方法

1.2.1 高效液相色譜分析 高效液相分析采用RPHPLC 紫外檢測法。高效液相色譜條件：色譜柱為Kromasail-C18 分析柱 （5 μm，4.6 mm×250 mm） 及ODS3預柱（5 μm，4.6 mm×10 mm），流動相為乙腈-0.1%乙酸（體積比40 ∶60），流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，紫外檢測器激發(fā)波長254 nm，進樣量20 μL，停止時間60 min。分析軟件為Lab solutions 色譜處理工作站，采用外標法計算提取液中的DNJ 含量：

DNJ 含量 （mg/g） =提取液 DNJ 濃度 （μg/mL） ×提取液體積（mL）/樣品質(zhì)量（g）/1 000

1.2.2 標準曲線繪制 精確稱取DNJ 標準品6.00 mg，置于100 mL 容量瓶中，加蒸餾水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得質(zhì)量濃度為60 μg/mL 的DNJ 標準品溶液母液。然后，用蒸餾水稀釋，依次配制成1、10、20、30、40、50、60 μg/mL 系列梯度濃度的 DNJ 標準品溶液。按照1.2.1 高效液相色譜條件進行上機分析，得到與不同濃度DNJ 標準溶液相對應的色譜峰面積值。

1.2.3 供試樣品測定

1.2.3.1 供試樣品溶液制備。精確稱取待測樣品0.25 g 置于50mL 離心管中，加入0.05mol/L 的HCl 溶液25 mL，渦旋混勻2 min，超聲波浸提30 min，而后12 000r/min 離心30min，收集上清液；將沉淀用上述方法重復提取1 次。合并2 次得到的上清液，用0.05 mol/L的HCl 溶液定容至50 mL，得到DNJ 的提取液。

1.2.3.2 衍生化處理。取DNJ 對照品溶液或者供試樣品提取液200 μL，加入0.4 mol/L 硼酸鹽緩沖液（pH值8.5） 338 μL，再加入 5 mmol/L 的 FMOC-Cl/乙腈溶液250 μL，充分混勻，25 ℃反應20 min，然后加入1 mol/L 的甘氨酸水溶液200 μL 終止反應；加入1%乙酸溶液132 μL 和超純水250 μL，混勻后用注射式0.22 μm 尼龍膜濾器過濾，收集濾液上機分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

利用SPSS 18.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學處理，并進行單因素方差分析。若有顯著差異，再采用LSD 法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 桑葉樣品中檢出DNJ 的高效液相色譜

高效液相色譜圖（圖1～3） 顯示，桑葉樣品中DNJ-FMOC 的保留時間為5.8 min，并且與其他組分之間有良好的基線分離；試劑中的水解副產(chǎn)物FMOC-OH和Gly-FMOC 與DNJ-FMOC 能良好分離，均不會干擾測定目標成分的準確性。

圖1 空白樣品的高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of blank samples

圖2 DNJ 標準品的高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of DNJ standard samples

圖3 桑葉樣品中DNJ 的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of DNJ in mulberry leaves samples

以標準品溶液濃度（X）為自變量、峰面積（Y）為因變量進行線性回歸分析（圖4），得到回歸方程為y=13 156x+5 411.7，相關系數(shù)R2=0.999 6。表明DNJ濃度在1～60 μg/mL 范圍內(nèi)，與峰面積呈良好的線性關系。

圖4 溶液濃度-峰面積標準曲線Fig.4 Standard curve between solution concentration and peak area

2.2 不同葉位桑葉的DNJ 含量變化

參試品種不同葉位桑葉的DNJ 含量變化趨勢基本相同，均隨葉位的不斷增加而降低（圖5～7）。其中，桲欏1～4 葉位桑葉的DNJ 含量為3.711 mg/g，顯著＞其他葉位處理；冀桑2 號1～4 葉位桑葉的DNJ 含量為2.453 mg/g，顯著＞其他葉位處理，而5 及以上葉位的桑葉DNJ 含量均差異不顯著；國桑21 號1～4 葉位桑葉的DNJ 含量為1.877 mg/g，顯著＞11 及以上葉位處理，而17 及以上葉位的桑葉DNJ 含量均差異不顯著?？梢钥闯?，同一品種桑葉DNJ 含量受葉位影響明顯，DNJ 含量隨葉片成熟度的增高而逐漸降低。

圖5 桲欏不同葉位桑葉的DNJ 含量Fig.5 DNJ content of mulberry leaves in different leaves position of Poluo

圖6 冀桑2 號不同葉位桑葉的DNJ 含量Fig.6 DNJ content of mulberry leaves in different leaves position of Jisang NO.2

圖7 國桑21 號不同葉位桑葉的DNJ 含量Fig.7 DNJ content of mulberry leaves in different leaves position of Guosang NO.21

2.3 桑樹不同部位的DNJ 含量變化

參試品種不同部位的DNJ 含量均存在顯著差異，其中桑枝皮層的DNJ 含量顯著＞桑葉，且桑枝不同部位皮層的DNJ 含量順序均為上部＜中部＜下部（表1）。表明桑樹枝條皮層的DNJ 含量從上向下越來越高，這可能與桑葉、桑枝皮層的生理功能不同有關。

表1 桑樹不同部位的DNJ 含量Table 1 DNJ content in different parts of mulberry（mg/g）

從不同品種的各部位DNJ 含量看，桲欏各部位的DNJ 含量均＞冀桑 2 號，其中桑葉的 DNJ 含量高49.0%，桑枝皮層上、中、下部的DNJ 含量分別高66.1%、98.1%和132.2%，差異均非常明顯。表明桲欏品種不同部位的DNJ 含量整體高于冀桑2 號，桑枝皮層中的DNJ 含量高于葉片中的含量。

2.4 桑葉不同部位的DNJ 含量變化

冀桑2 號桑葉不同部位的DNJ 含量順序為葉片＞葉柄＞全葉＞葉脈，但差異均不顯著（表2）。

表2 桑葉不同部位的DNJ 含量Table 2 DNJ content in different parts of mulberry leaves （mg/g）

進一步對葉片和葉脈上半部與下半部的DNJ 含量進行分析發(fā)現(xiàn)，二者均表現(xiàn)為上半部DNJ 含量＞下半部。因此，預測冀桑2 號葉片的DNJ 含量分布為越靠近上部越高（圖4）。分析原因，可能與葉片各部位的生理功能以及防御害蟲的功能有關。

圖4 桑葉DNJ 含量分布預測圖Fig.4 Prediction map of DNJ contents distribution in mulberry leaves

3 結(jié)論與討論

以我國北方地區(qū)3 個耐寒桑品種國桑21 號、冀桑 2 號和桲欏為試材，對葉片和和枝皮中的DNJ 含量進行測定，并分析了DNJ 在桑樹不同部位以及桑葉不同葉位和不同部位的分布情況。結(jié)果顯示：

（1）3 個桑品種不同葉位桑葉的DNJ 含量存在顯著差異。本試驗中將枝條上的桑葉按照1～4、5～10、11～16、17～25、26～39、40～60 分為不同的葉位，測定結(jié)果顯示，隨著葉位（成熟度） 增加，桑葉中的DNJ 含量逐漸減少。這與葉晶晶等[13]、魏兆軍等[16]和金超等[21]的“桑葉中1-DNJ 含量均隨葉位的增加而逐漸減小，即不同成熟度的桑葉DNJ 含量順序為嫩葉＞成熟葉＞老葉”研究結(jié)果相一致。原因是不同葉位的葉片大小不同，而生長階段不同植物體內(nèi)的有機物進入韌皮部后，可向上傳輸?shù)秸谏L的莖枝頂端，即嫩葉或正在成長的果實[22]，因此桑枝上部葉片中的營養(yǎng)物質(zhì)充足，活性物質(zhì)含量也相應較高。

（2）桲欏和冀桑2 號桑枝皮中的DNJ 含量較桑葉高且穩(wěn)定。與耿鵬等[23]、劉衛(wèi)旗等[15]和陳正收等[24]的相關報道一致。其中，桑枝不同部位皮層的DNJ 含量順序為上部＜中部＜下部，這可能與桑枝皮層轉(zhuǎn)運的生理功能有關。由桑葉合成的DNJ 可能通過皮層自上而下輸送到桑樹的各個部位，因此，桑枝下部皮層的DNJ含量相對較高。

（3）冀桑2 號桑葉不同部位的DNJ 含量順序為葉片＞葉柄＞全葉＞葉脈；并且葉片和葉脈的上半部DNJ含量均高于下半部，與朱見[25]的研究結(jié)果一致。我們推測DNJ 可能與葉片的生長有關，DNJ 合成后逐漸擴散到葉脈中，然后進入到葉柄通過韌皮部進而運輸?shù)缴涞母鱾€部位。另外，Konno 等[26]研究發(fā)現(xiàn)，植物中大多數(shù)與防御有關的次生代謝物質(zhì)都是合成后通過脈管運輸?shù)?，DNJ 在葉片中的分布規(guī)律也證實了這一點。因此，要增加DNJ 含量，提高植物脈管的運輸能力可能是一個重要途徑。

本試驗結(jié)果說明，河北傳統(tǒng)抗寒桑樹品種桲欏桑的DNJ 綜合含量較高，其中枝條皮層的含量遠大于桑葉，是較好的降糖藥用資源。桑樹中的DNJ 含量隨著其合成、轉(zhuǎn)運、貯存而表現(xiàn)出明顯的變化規(guī)律，而且往往易受害蟲侵害的幼嫩部位DNJ 含量較高，這很可能與其防御害蟲的功能有關。至于DNJ 與防御機制之間的具體聯(lián)系，還需進一步探明，從而為桑樹的進一步開發(fā)利用提供更為可靠的依據(jù)。