UBE2C基因在結(jié)直腸癌中表達(dá)及其對(duì)患者預(yù)后預(yù)測(cè)價(jià)值分析

高 峰，劉 嬌，孫 勇，王 靜，高 原，楊 琳，孫亞男，李 玲，楊 卓

北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 1.內(nèi)窺鏡科;2.婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016

結(jié)直腸癌發(fā)病率位居惡性腫瘤的第三位，病死率位居第二位，嚴(yán)重威脅患者的生命健康[1]。泛素-蛋白酶體通路由泛素樣共軛系統(tǒng)和蛋白酶體組成，承擔(dān)細(xì)胞內(nèi)90%左右的蛋白質(zhì)降解工作。泛素樣共軛系統(tǒng)由泛素激活酶、泛素偶聯(lián)酶、泛素連接酶及泛素水解酶等組成[2-4]。UBE2C屬于泛素偶聯(lián)酶家族成員，其基因位于染色體20q12.13[5]。既往研究表明，UBE2C可以介導(dǎo)APC/C特異性靶蛋白的泛素化進(jìn)程。共刺激分子細(xì)胞分裂周期蛋白(cell division cycle 20，CDC20)或鈣黏附蛋白1(cadherin 1，Cdh1)與APC/C形成復(fù)合物(APC/C CDC20或APC/C Cdh1)，協(xié)助泛素分子從UBE2C傳遞到靶分子上[6]。本研究旨在探討UBE2C基因在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)及其對(duì)患者預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)提取 利用TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/)選擇數(shù)據(jù)來(lái)源為“COADREAD”中Seq-FPKM格式的RNA-seq數(shù)據(jù)，同時(shí)輸入基因名稱(chēng)“UBE2C”檢索，下載原始數(shù)據(jù)進(jìn)行差異表達(dá)分析。共下載698例組織數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其中結(jié)直腸癌組織647例，癌旁組織51例。

1.2 UBE2C的表達(dá)情況分析 選取自2016年1月至2017年6月于北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的50例結(jié)直腸癌患者為研究對(duì)象。所有患者術(shù)前未進(jìn)行放化療治療。術(shù)中留取50例結(jié)直腸癌組織與對(duì)應(yīng)的癌旁組織(距離腫瘤邊緣>3 cm)。Trizol法提取組織RNA，Nanodrop 2 000檢測(cè)樣本濃度與純度，組織RNA通過(guò)Prime-script RT試劑盒(Takara)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，然后利用SYBR Premix ExTaq(Takara)試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)，檢測(cè)結(jié)直腸癌與癌旁組織中UBE2C的mRNA表達(dá)水平(引物序列為GAPDH-Forward:GGGAAACTGTGGCGTGAT;GAPDH-Reverse:GAGTGGGTGTCGCTGTTGA;UBE2C-Forward:GGATTTCTGCCTTCCCTGAA;UBE2C-Reverse:GATAGCAGGGCGTGAGGAAC)。收集臨床樣本的相關(guān)信息進(jìn)行生存分析。

1.3 相關(guān)基因分析及蛋白互作預(yù)測(cè) 利用Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)(http://ualcan.path.uab.edu/)分析與UBE2C表達(dá)相關(guān)的基因，gene symbol處輸入U(xiǎn)BE2C，腫瘤類(lèi)型選擇結(jié)腸癌，點(diǎn)擊correlation檢索。利用String數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)可能與UBE2C結(jié)合的蛋白。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果 結(jié)直腸癌組織中UBE2C分子表達(dá)水平顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1a)。UBE2C在不同腫瘤分期、不同淋巴結(jié)分期、不同腫瘤轉(zhuǎn)移分期結(jié)直腸癌組織中表達(dá)均無(wú)明顯變化(P>0.05，圖1b～1d)。選取50例配對(duì)的結(jié)直腸癌與癌旁組織進(jìn)行差異表達(dá)分析結(jié)果顯示，癌組織中UBE2C表達(dá)高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1e)。ROC曲線分析結(jié)果顯示，曲線下面積為0.977，95%可信區(qū)間為0.967～0.987，cut-off值為4.982，靈敏度和特異度分別為0.980、0.998(圖1f)。

圖1 結(jié)直腸癌組織與癌旁組織中UBE2C表達(dá)水平(a.結(jié)直腸癌與癌旁組織中UBE2C表達(dá)水平；b.不同腫瘤分期的結(jié)直腸癌與癌旁組織中UBE2C表達(dá)水平；c.不同淋巴結(jié)分期的結(jié)直腸癌與癌旁組織UBE2C表達(dá)水平；d.不同腫瘤轉(zhuǎn)移分期的結(jié)直腸癌與癌旁組織中UBE2C表達(dá)水平；e.50例配對(duì)結(jié)直腸癌與癌旁組織中UBE2C表達(dá)水平；f.ROC曲線)

2.2 RT-PCR及生存分析結(jié)果 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，UBE2C在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2a)。生存分析結(jié)果顯示，UBE2C高表達(dá)患者的生存期顯著低于UBE2C低表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2b)。

圖2 RT-PCR及生存分析結(jié)果(a.RT-PCR檢測(cè)結(jié)果；b.生存分析結(jié)果)

2.3 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與UBE2C表達(dá)相關(guān)的基因 Ualcan數(shù)據(jù)庫(kù)及String數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果顯示，AURKA與UBE2C相關(guān)性最高，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.83。見(jiàn)圖3。

圖3 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與UBE2C表達(dá)相關(guān)的基因(a.String數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)與UBE2C可能結(jié)合的蛋白；b.UBE2C與AURKA的相關(guān)性分析)

3 討論

泛素化在蛋白質(zhì)降解過(guò)程中扮演著非常重要的角色，參與了一系列的生物過(guò)程，如細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、腫瘤的發(fā)生發(fā)展等。UBE2C在多數(shù)腫瘤組織中呈高表達(dá)[2]。Zhao等[7]利用RT-PCR和免疫組化的方法檢測(cè)了UBE2C在胰腺癌中的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，UBE2C的表達(dá)與胰腺癌的臨床分期、腫瘤細(xì)胞的分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者的總體生存期相關(guān)，可作為胰腺癌預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子。Morikawa等[8]利用組織芯片的方法檢測(cè)了UBE2C在膀胱癌中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)UBE2C信號(hào)陽(yáng)性組中的腫瘤組織多屬于pT2～pT4期，而UBE2C信號(hào)陰性組中的腫瘤組織多屬于pTis/pT1期。另外，UBE2C在間葉源性腫瘤、肺癌、食管鱗癌組織中均呈高表達(dá)[9-15]。這提示，UBE2C可能成為腫瘤的潛在標(biāo)志物。本研究利用數(shù)據(jù)庫(kù)與臨床樣本檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，UBE2C在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織，且與患者生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。進(jìn)一步挖掘數(shù)據(jù)庫(kù)尋找與UBE2C相關(guān)的分子發(fā)現(xiàn)，AURKA與UBE2C密切相關(guān)，Pearson相關(guān)系數(shù)為0.83，且String數(shù)據(jù)庫(kù)也檢測(cè)到AURKA與UBE2C存在相互作用。AURKA位于20號(hào)染色體，AURKA的功能可能與P53通路的調(diào)控、中心體擴(kuò)增、細(xì)胞分裂調(diào)控相關(guān)[16-17]。既往研究表明，AURKA與結(jié)直腸癌的不良預(yù)后相關(guān)，其蛋白表達(dá)水平在預(yù)測(cè)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移中具有重要意義，有成為結(jié)直腸癌分子標(biāo)志物的潛力[18]。綜上所述，UBE2C在結(jié)直腸癌組織中顯著上調(diào)，且與患者生存期呈負(fù)相關(guān)，與AURKA的相關(guān)性較高，可能通過(guò)與AURKA相互作用發(fā)揮作用。