不同染料標(biāo)識(shí)木栓細(xì)胞壁中木栓脂的分布

張 寶，陳冰煒，翟勝丞,2*，潘 彪，魏建強(qiáng)，勇 強(qiáng)

(1.南京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南京林業(yè)大學(xué) 林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；3.南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037)

木栓細(xì)胞(phellem cell)，即軟木細(xì)胞(cork)[1]，其細(xì)胞壁主要成分為木栓脂(suberin)、木質(zhì)素(lignin)、多糖(polysaccharide)等高分子聚合物[2-3]；如栓皮櫟軟木中木栓脂的質(zhì)量分?jǐn)?shù)約40%[4-5]。木栓脂化學(xué)性質(zhì)比較穩(wěn)定，具有較好的耐腐性和耐老化性。目前軟木的主要應(yīng)用是通過(guò)與其他材料復(fù)合以制備板材，可賦予板材一定吸振、吸聲的功能，可滿足公共場(chǎng)所和家庭場(chǎng)所的減噪需求[6]；木栓脂可通過(guò)己酸膽堿催化解聚以最大程度的保留木栓脂的分子完整性、進(jìn)而加工制成具有一定程度的抗菌性、防水性的薄膜，具有良好的應(yīng)用前景[11]。

木栓脂化學(xué)結(jié)構(gòu)與木質(zhì)素有較大不同，因此可通過(guò)不同染料對(duì)于化學(xué)組分的特異性染色來(lái)進(jìn)行區(qū)分。染色對(duì)觀察生物材料的組織結(jié)構(gòu)、化學(xué)組分分布等至關(guān)重要，將生物材料進(jìn)行染色，可以對(duì)細(xì)胞或細(xì)胞壁中的某特定化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行染色，以觀察該化學(xué)物質(zhì)在細(xì)胞或細(xì)胞壁中的分布。如K.Kobayashi等[7]使用甲苯胺藍(lán)對(duì)日本晚櫻栓質(zhì)化細(xì)胞進(jìn)行染色，觀察到木質(zhì)素主要存在于栓質(zhì)化細(xì)胞的細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)部分。

根據(jù)前人研究，植物細(xì)胞染色常用染料有甲苯胺藍(lán)[7]、硫酸氫黃連素[8]、番紅O、固綠[9]、蘇丹類染料[10]、間苯三酚顯色反應(yīng)[11-12]等，適用于木質(zhì)化或者栓質(zhì)化細(xì)胞的染色[13]，但是如何區(qū)分細(xì)胞壁層中木質(zhì)化和栓質(zhì)化部分，仍有待摸索。日本晚櫻樹(shù)皮中的木栓細(xì)胞具有較好的柔韌性，且細(xì)胞在弦向可伸長(zhǎng)至原始尺寸的2到3倍[7]。本研究采用了蘇丹Ⅲ染色法、蘇丹紅7B染色法、甲苯胺藍(lán)染色法、硫酸氫黃連素-苯胺藍(lán)對(duì)染法和鹽酸-間苯三酚染色法五種染色方法對(duì)日本晚櫻樹(shù)皮切片進(jìn)行染色，采用光學(xué)顯微鏡(含熒光顯微鏡)進(jìn)行觀察，確定木栓細(xì)胞在樹(shù)木周皮中的分布及木栓脂在木栓細(xì)胞不同壁層的分布。通過(guò)比較不同染色方法，開(kāi)展日本晚櫻(Cerasusserrulata)樹(shù)皮中栓質(zhì)化細(xì)胞壁主要化學(xué)成分分布的研究，有助于后期進(jìn)一步深入了解木栓細(xì)胞在植物生長(zhǎng)過(guò)程中的形成及木栓脂堆積的過(guò)程，掌握周皮對(duì)植物保護(hù)作用的機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)對(duì)象：日本晚櫻樹(shù)皮取自南京林業(yè)大學(xué)校園，從樹(shù)干上取得尺寸為10 mm×10 mm×5 mm(L×T×R)的樹(shù)皮。

染料：蘇丹Ⅲ(Sudan Ⅲ，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司)，蘇丹紅7B(Sudan Red 7B，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)有限公司)，甲苯胺藍(lán)O(Toluidine Blue O，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，苯胺藍(lán)(Aniline Blue，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，硫酸氫黃連素(Berberine Bisulfate，上海麥克林生化科技有限公司)，間苯三酚(Phloroglucinol，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)。

包埋劑：LR-white樹(shù)脂(London Resin Company Ltd)，環(huán)氧樹(shù)脂Epon812(Epon812、NMA、DDSA、DMP-30產(chǎn)自Structure Probe公司)。

其他：FAA固定液(磷酸二氫鈉4.0 g，磷酸氫二鈉6.5 g，37%甲醛100.0 mL，蒸餾水900.0 mL，浙江金華同和生物技術(shù)有限公司)，鹽酸(Hydrochloride，南京化學(xué)試劑股份有限公司)，聚乙二醇200(上海靈峰化學(xué)試劑有限公司)，丙三醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 樣品包埋 環(huán)氧樹(shù)脂Epon812包埋：樣品飽水、戊二醛固定、PBS緩沖液調(diào)節(jié)pH、酒精梯度脫水、丙酮梯度脫酒精、配置樹(shù)脂、樣品包埋、樹(shù)脂聚合(37℃，過(guò)夜；45℃，12 h；60℃，24 h)。

LR-white樹(shù)脂包埋：樣品飽水、配置樹(shù)脂(向500 g樹(shù)脂中加入9.9 g催化劑，避光混合均勻)、樣品包埋(將飽水后的樣品放入樹(shù)脂中)、樹(shù)脂聚合(在65℃烘箱中進(jìn)行樹(shù)脂聚合)。

1.2.2 切片制備 待日本晚櫻樹(shù)皮在FAA組織固定液中浸泡24 h后，將樹(shù)皮修成1 mm×1 mm×3 mm的小樣，分別采用LR-white樹(shù)脂和Epon812環(huán)氧樹(shù)脂進(jìn)行包埋。包埋樣品經(jīng)單面刀修樣后，使用半薄切片機(jī)(LEICA，RM2265)進(jìn)行切片，切片厚度為3 μm。

1.2.3 染液配制及切片染色 本實(shí)驗(yàn)所用染料分別為甲苯胺藍(lán)染液、蘇丹紅7B染液、硫酸氫黃連素染液、苯胺藍(lán)染液、蘇丹Ⅲ染液和間苯三酚染液，染液詳細(xì)配制方法如表1所示。染液配制好后，按照表2中的染色步驟進(jìn)行染色。染色后的切片，經(jīng)漂洗浮色后，進(jìn)行封片。封片劑為甘油水溶液。

1.2.4 切片觀察 使用型號(hào)OLYMPUS，BX51熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。藍(lán)色激發(fā)光波長(zhǎng)450～480 nm，拍照設(shè)備OPLENIC DIGITAL CAMEREA。

2 結(jié)果與分析

2.1 普通染料染色

分別采用甲苯胺藍(lán)、鹽酸-間苯三酚、蘇丹Ⅲ和蘇丹紅7B對(duì)日本晚櫻樹(shù)皮經(jīng)環(huán)氧樹(shù)脂Epon812包埋后的切片進(jìn)行染色，并采用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行觀察，顯微圖像如圖1所示。圖1a為未染色顯微圖像，圖中木栓細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整，細(xì)胞間無(wú)細(xì)胞間隙，且相鄰細(xì)胞間的連接方式為搭接。圖1b為鹽酸-間苯三酚染色結(jié)果，間苯三酚在酸性條件下主要使木質(zhì)化的細(xì)胞壁著色[14]，但在圖中并未觀察到木質(zhì)素被染上顏色，這可能與包埋時(shí)所用樹(shù)脂相關(guān)。圖1c為蘇丹Ⅲ染色結(jié)果，可觀察到木栓細(xì)胞壁在染色后分為兩個(gè)部分，木栓細(xì)胞壁遠(yuǎn)離細(xì)胞腔部分(即細(xì)胞壁外側(cè))被染上紅色，靠近細(xì)胞腔的細(xì)胞壁(即細(xì)胞壁內(nèi)側(cè))仍為無(wú)色。蘇丹Ⅲ為脂溶性染料，易溶于脂類物質(zhì)可使脂類物質(zhì)著色[7]，圖1d為蘇丹紅7B染色結(jié)果，可以看到木栓細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)部分為無(wú)色，木栓細(xì)胞壁的外側(cè)部分為紫紅色，其染色結(jié)果與蘇丹Ⅲ類似，可使木栓細(xì)胞細(xì)胞壁的木栓脂著色。

注：箭頭：木質(zhì)素，箭：木栓脂，標(biāo)尺=20 μm。

表1 不同染料的配制方法Table 1 Preparation of different dyes

表2 5種染色方法染色步驟Table 2 Dyeing steps

2.2 熒光染料

2.2.1 甲苯胺藍(lán)染色 甲苯胺藍(lán)作為染料既可以在明場(chǎng)下觀察，也可以在熒光下觀察。使用熒光顯微鏡觀察未染色、甲苯胺藍(lán)染色及硫酸氫黃連素染色效果，如圖2所示。圖2a為未染色切片在明場(chǎng)下的顯微圖片，可以看到徑切面上木栓細(xì)胞形態(tài)不規(guī)整。圖2b為未染色切片在藍(lán)色激發(fā)光下的顯微圖片，圖中木栓細(xì)胞熒光強(qiáng)度與顏色相差不大，較難區(qū)分木栓細(xì)胞壁的成分分布。圖2c為甲苯胺藍(lán)染色明場(chǎng)下顯微圖片木栓細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)染上藍(lán)色，木栓細(xì)胞壁的外側(cè)著色較淺至無(wú)色。圖2d為甲苯胺藍(lán)染色切片在熒光顯微鏡下的圖片，與未染色切片在紫色激發(fā)光下觀察比較，發(fā)現(xiàn)木質(zhì)素的熒光消失，木栓脂的熒光變暗。甲苯胺藍(lán)主要使細(xì)胞壁中木質(zhì)素及多糖類物質(zhì)著色[7]。蘇丹Ⅲ與蘇丹紅7B均為脂溶性染料，而木栓細(xì)胞中含有的脂類物質(zhì)主要為木栓脂，因此蘇丹Ⅲ染色后顯紅色的細(xì)胞壁為木栓脂。甲苯胺藍(lán)、蘇丹Ⅲ和蘇丹紅7B染色結(jié)果均表明木栓細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)部分主要成分為木質(zhì)素和多糖，外側(cè)部分主要成分為木栓脂。甲苯胺藍(lán)染色后木質(zhì)素與木栓脂的熒光均變暗，說(shuō)明在藍(lán)色激發(fā)光下甲苯胺藍(lán)可以抑制木質(zhì)素和木栓脂的自發(fā)熒光[15]，表明甲苯胺藍(lán)主要使木質(zhì)素著色，也可使木栓脂著色但著色程度較淺。

注:a為未染色，b為未染色切片在藍(lán)色激發(fā)光下的顯微圖片，c為甲苯胺藍(lán)染色，d為甲苯胺藍(lán)染色切片在藍(lán)色激發(fā)光下的顯微圖片，箭頭：木質(zhì)素，箭：木栓脂，標(biāo)尺=20 μm。

2.2.2 硫酸氫黃連素-苯胺藍(lán)對(duì)染法 硫酸氫黃連素-苯胺藍(lán)對(duì)染法染色結(jié)果如圖3所示，硫酸氫黃連素-苯胺藍(lán)為熒光染色，在明場(chǎng)下(圖3a)較難分辨木栓脂和木質(zhì)素不同。藍(lán)色激發(fā)光下硫酸氫黃連素的染色結(jié)果(圖3b)發(fā)現(xiàn)，木栓細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)呈現(xiàn)為黃綠色，細(xì)胞壁的外側(cè)呈現(xiàn)為灰綠色。硫酸氫黃連素-苯胺藍(lán)染色后就染色效果與圖1b中未染色相比，染色后木質(zhì)素與木栓脂的熒光得到不同程度的增強(qiáng)，從而觀察到木質(zhì)素和木栓脂的分布。根據(jù)前人研究[16]硫酸氫黃連素-苯胺藍(lán)對(duì)染法中，硫酸氫黃連素主要使木栓脂的熒光增強(qiáng)；苯胺藍(lán)可作為木質(zhì)素自發(fā)熒光的抑制劑[17]，在激發(fā)光下可觀察到木質(zhì)素的自發(fā)熒光變暗。結(jié)合以上分析可知，硫酸氫黃連素-苯胺藍(lán)對(duì)染色法，可在增強(qiáng)木栓脂的熒光同時(shí)，抑制木質(zhì)素的自發(fā)熒光，從而在熒光顯微鏡下區(qū)分并確定木栓細(xì)胞壁木栓脂和木質(zhì)素的分布。

注:a為染色后明場(chǎng)下顯微圖片，b為染色后藍(lán)色激發(fā)光下的顯微圖片，箭頭：木質(zhì)素，箭：木栓脂，標(biāo)尺=20 μm。

2.3 鹽酸-間苯三酚染色切片改良

圖1b為使用環(huán)氧樹(shù)脂包埋后制作切片染色結(jié)果，其染色效果較差。為探究不同包埋樹(shù)脂對(duì)染色效果的影響，根據(jù)間苯三酚的化學(xué)性質(zhì)，選用親水性樹(shù)脂LR-white樹(shù)脂對(duì)日本晚櫻樹(shù)皮進(jìn)行包埋，切片后再次染色。發(fā)現(xiàn)圖4中木栓細(xì)胞細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)被染上了紅棕色，間苯三酚在酸性條件下主要使木質(zhì)素著色，由此可知木栓細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)主要成分為木質(zhì)素，這與前面的染色結(jié)果相互驗(yàn)證，也表明使用親水性染料染色時(shí)，LR-white樹(shù)脂包埋后切片的染色效果優(yōu)于環(huán)氧樹(shù)脂包埋染色效果。鹽酸-間苯三酚染色法對(duì)環(huán)氧樹(shù)脂和LR-white兩種樹(shù)脂包埋后的切片進(jìn)行染色后，環(huán)氧樹(shù)脂包埋后的切片仍為無(wú)色，而LR-white樹(shù)脂包埋后切片木栓細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)被染上櫻紅色，表明樹(shù)脂對(duì)鹽酸-間苯三酚染色有影響，主要原因?yàn)長(zhǎng)R-white樹(shù)脂為親水性樹(shù)脂，且間苯三酚具有羥基，因此，間苯三酚更容易作用于切片使木質(zhì)素著色。

注:箭頭：木質(zhì)素，箭：木栓脂，標(biāo)尺=20 μm。

3 結(jié)論

染色后在明場(chǎng)下觀察，蘇丹Ⅲ的染色效果最好，可以直接將木栓脂染成紅色。同時(shí)結(jié)合甲苯胺藍(lán)、蘇丹紅7B和鹽酸-間苯三酚染色確定木栓脂主要存在于木栓細(xì)胞壁的最外層。

甲苯胺藍(lán)可以抑制木質(zhì)素的自發(fā)熒光，避免木質(zhì)素的自發(fā)熒光的干擾，直接觀察到木栓脂的熒光。

硫酸氫黃連素-苯胺藍(lán)染色后，木栓脂的熒光在木栓細(xì)胞壁外側(cè)呈灰綠色，木質(zhì)素的熒光在木栓細(xì)胞壁的內(nèi)側(cè)呈黃綠色。

鹽酸-間苯三酚染色后，木栓細(xì)胞壁內(nèi)側(cè)的木質(zhì)素呈現(xiàn)為紅棕色，且環(huán)氧樹(shù)脂包埋會(huì)降低鹽酸-間苯三酚的染色效果。