玉米生長素響應(yīng)因子家族基因的表達(dá)模式分析

李文蘭 李文才 孫 琦 于彥麗 趙 勐 魯守平 李艷嬌 孟昭東

玉米生長素響應(yīng)因子家族基因的表達(dá)模式分析

李文蘭 李文才 孫 琦 于彥麗 趙 勐 魯守平 李艷嬌 孟昭東*

山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院玉米研究所 / 小麥玉米國家工程實驗室 / 農(nóng)業(yè)部黃淮海北部玉米生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室, 山東濟南 250100

生長素響應(yīng)因子(auxin response factor, ARF)是一類重要的轉(zhuǎn)錄因子, 通過特異性地結(jié)合生長素響應(yīng)元件調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄, 參與諸多植物生長發(fā)育過程的調(diào)控。玉米中有許多家族基因, 但其表達(dá)模式有待深入研究。本研究分析了玉米家族基因在不同組織器官中的表達(dá), 發(fā)現(xiàn)除、和組成型表達(dá)外, 其余32個基因的表達(dá)水平在生殖器官中要明顯高于營養(yǎng)器官。對基因啟動子區(qū)的順式作用元件分析顯示, 28個基因的啟動子區(qū)含有逆境脅迫相關(guān)順式元件, 實時定量PCR分析結(jié)果顯示, 多個基因分別響應(yīng)冷、熱、鹽和滲透脅迫。研究結(jié)果不僅暗示了家族基因在玉米生殖生長和非生物逆境脅迫響應(yīng)中的重要性, 也為全面解析基因在玉米中的生物學(xué)功能提供有用信息。

; 表達(dá); 逆境脅迫; 玉米

生長素響應(yīng)因子(auxin response factor, ARF)是植物所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子[1], 通過特異性地結(jié)合生長素響應(yīng)元件(AuxREs)調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄, 參與諸多植物生長發(fā)育過程的調(diào)控, 例如向性運動、頂端優(yōu)勢、干旱脅迫響應(yīng)等。研究基因的表達(dá)模式對于全面了解玉米基因家族的生物學(xué)功能具有重要意義。

生長素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程涉及早期響應(yīng)基因(、和基因家族等)和與AuxREs相互作用的家族基因[2]。ARF蛋白結(jié)合到生長素調(diào)控基因啟動子區(qū)的生長素響應(yīng)元件(5'-TGTCTC-3')上, 抑制或激活這些基因的轉(zhuǎn)錄[3], 從而影響植物的生長發(fā)育。擬南芥、水稻、二穗短柄草、鷹嘴豆和丹參等多種植物中的基因已有相關(guān)研究[4-9]。擬南芥中第一個被發(fā)現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄因子是, 是以人工合成的生長素響應(yīng)元件為誘餌,通過活性很高的酵母單雜系統(tǒng)克隆得到的[3]。ARF1蛋白包括665個氨基酸, N端包含1個DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域; 中間的一段區(qū)域富含脯氨酸, 絲氨酸和蘇氨酸含量也較高[3], 與其他富含脯氨酸結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄抑制子和轉(zhuǎn)錄激活子序列類似[4], 該區(qū)域可能是轉(zhuǎn)錄抑制或轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域; C端與基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域III和IV有類似結(jié)構(gòu)[3,10]。擬南芥中有22個基因編碼ARF蛋白[11], 其中參與胚胎發(fā)生與維管形成[12];參與植物向光性和向重力性[13];控制葉擴展和側(cè)根生長, 并與表現(xiàn)出功能冗余性[14-15];和參與花成熟調(diào)控, 且呈現(xiàn)功能冗余性[16]。此外, 馬鈴薯參與頂端休眠, 調(diào)控與頂端分生組織連接維管束的發(fā)育[17]; 水稻受生長素誘導(dǎo), 參與胚芽鞘的向性運動[18]; 番茄也是家族基因, 參與種子發(fā)育、幼苗生長和果實成熟[19]。

玉米有35個基因[20], 基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系等已有相關(guān)分析, 但其表達(dá)模式還有待深入研究。關(guān)于基因在玉米不同組織器官中的表達(dá)模式以及在冷、熱、鹽和滲透脅迫下的表達(dá)模式還未見詳細(xì)報道。Liu等[20]通過全基因組序列分析, 找到了35個玉米基因, 并對基因結(jié)構(gòu)和進(jìn)化關(guān)系等進(jìn)行了分析。本研究擬通過分析基因在玉米不同組織器官中的表達(dá)模式以及在冷、熱、鹽和滲透脅迫下的表達(dá)模式, 探究基因在玉米生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)過程中的作用, 為全面解析玉米基因的生物學(xué)功能提供有用信息。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與生長條件

試驗所用的玉米材料是B73自交系。分別取材播種后14 d (V3時期)的初級根、第2片葉、整個幼苗植株、播種后25 d (V5時期)的中部莖稈和播種后34 d (V7時期)的整個幼嫩雄花序及雌花序, 用于實時定量PCR分析。逆境脅迫試驗所用的材料在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行長日照培養(yǎng)(16 h光照/8 h黑暗), 生長14 d。冷脅迫處理是將幼苗置于4℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理, 熱脅迫處理是將幼苗置于40℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行處理, 鹽脅迫處理是利用250 mmol L–1的NaCl對幼苗進(jìn)行處理, 滲透脅迫處理是利用15% PEG-6000對幼苗進(jìn)行處理。每種脅迫處理均在處理0、1、2、4和8 h后, 收集對照植株和處理植株的第2片葉用于實時定量PCR分析。

1.2 RNA提取和實時定量PCR分析

利用天根的多糖多酚總RNA提取試劑盒提取各樣品的總RNA, 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書完成cDNA的合成和純化。實時定量PCR分析利用Bio-Rad CFX96實時定量檢測系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules, CA, USA), 引物序列見表1,基因作為內(nèi)參基因, 根據(jù)2-DDCT計算基因相對表達(dá)量。對于脅迫處理下玉米幼苗的qRT-PCR分析, 將各處理0 h各基因表達(dá)量設(shè)為1, 并以此對照計算其在其他時間點的相對表達(dá)量。實驗數(shù)據(jù)通過SPSS18.0軟件進(jìn)行差異性分析。

1.3 利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對ARF基因進(jìn)行表達(dá)分析

利用從MaizeGDB數(shù)據(jù)庫獲得的玉米基因的ID號在Genevestigator網(wǎng)站(http://www.genevestigator. com/gv/)搜索基因在不同組織器官中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)數(shù)據(jù), 然后利用Genevestigator網(wǎng)站的系統(tǒng)軟件對轉(zhuǎn)錄組表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析, 獲得基因在不同組織器官中的表達(dá)模式熱點分布圖[21]。

1.4 啟動子區(qū)順式作用元件分析

利用Gramene網(wǎng)站(http://ensembl.gramene.org/ Zea_mays/Info/Index)搜索確定玉米家族基因起始密碼子上游1500 bp的啟動子區(qū)序列, 利用PlantCare數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/ webtools/plantcare/html/)的順式作用元件分析工具, 對玉米家族基因啟動子區(qū)序列進(jìn)行順式作用元件分析[22]。

2 結(jié)果與分析

2.1 玉米ARF家族基因在不同組織器官中的表達(dá)分析

為探究生長素響應(yīng)因子家族成員在玉米中的表達(dá)模式, 我們利用實時定量PCR方法對基因在6種不同組織器官(根、莖、葉、幼苗、幼嫩雄花序和幼嫩雌花序)中的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(圖1)。、和在玉米中組成型表達(dá),在莖、幼苗和雄花序中高表達(dá),在葉和雌花序中高表達(dá), 而剩余的30個基因均在雄花序和雌花序中優(yōu)勢表達(dá)。從整體空間表達(dá)上看, 各基因的表達(dá)量高低呈現(xiàn)生殖器官>營養(yǎng)器官。玉米花序發(fā)育涉及小穗對原基、小穗原基、花器官原基等各類原基發(fā)育起始過程, 在這些原基起始部位都存在生長素積累和轉(zhuǎn)運[23]。作為生長素響應(yīng)因子,基因在雌花序和雄花序中高水平表達(dá), 暗示基因參與花序發(fā)育調(diào)控過程。

表1 實時定量PCR的引物序列

(續(xù)表1)

2.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中玉米ARF家族基因在不同組織器官中的表達(dá)分析

為進(jìn)一步了解玉米家族基因的表達(dá)模式, 我們利用Genevestigator數(shù)據(jù)庫中的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對家族基因在更多不同組織器官(41個組織器官)中的表達(dá)模式進(jìn)行了分析, 共獲得31個玉米基因(未獲得、、和這4個基因的表達(dá)信息)的表達(dá)信息, 結(jié)果如圖2所示。除了花粉,、和在所檢測的其余組織器官中均有表達(dá), 這與實時定量PCR結(jié)果基本吻合。

和在花藥中優(yōu)勢表達(dá), 這與定量結(jié)果顯示其在雄花序中優(yōu)勢表達(dá)是一致的。此外, 除了和, 其余29個玉米基因在雌花序發(fā)育(pistil, ovary, ear, spikelet)和種子發(fā)育過程(embryo, endosperm, embryo sac, embryo-surrounding region, basal endosperm transfer layer)中均有較高的表達(dá)量。這與實時定量PCR結(jié)果顯示基因在生殖器官發(fā)育過程中優(yōu)勢表達(dá)也是一致的。然而, 與定量結(jié)果顯示基因在莖中低表達(dá)(除了和)相反, 有29個基因(除和)在莖中具有較高的表達(dá)水平。這可能是由于取材時期和試驗材料不同所造成的結(jié)果差異。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和實時定量PCR結(jié)果, 我們可以推測基因在玉米生長發(fā)育和生殖器官發(fā)育過程中均發(fā)揮著重要的作用。

R: 根; ST: 莖; L: 葉; S: 幼苗; T: 雄花序; E: 雌花序。圖柱上的不同字母代表Duncan’s multiple range tests的顯著差異(< 0.05)。

R: root; ST: stem; L: leaf; S: seedling; T: tassel; E: ear. Values marked with different letters indicate significant differences at< 0.05 by Duncan’s multiple range tests.

圖中每個基因在所有檢測組織器官中的表達(dá)量設(shè)為100%, 顏色的深淺代表表達(dá)百分率。

The relative expression of each gene in all detected tissues and organs was set at 100%, and the shade of color represents the percentage of relative expression levels.

2.3 玉米ARF家族基因的順式作用元件分析

為更好了解玉米家族基因在逆境脅迫響應(yīng)過程中的作用, 我們對玉米家族基因起始密碼子上游1500 bp的啟動子區(qū)進(jìn)行順式作用元件分析(表2), 除轉(zhuǎn)錄和光響應(yīng)相關(guān)必需順式作用元件, 在玉米家族基因的啟動子區(qū)找到大量順式作用元件, 根據(jù)功能可分為: 植物激素響應(yīng)相關(guān)順式作用元件(Element A)、生長發(fā)育相關(guān)順式作用元件(Element B)和逆境脅迫相關(guān)順式作用元件(Element C)。Element A中的脫落酸響應(yīng)元件(ABRE)分布于除和ARF19之外的每一個基因啟動子區(qū), 茉莉酸甲酯響應(yīng)元件(CGTCA-motif, TGACG-motif, MeJA-responsive element)分布在除ARF14、、、和ARF35之外的30個基因啟動子區(qū), 赤霉素響應(yīng)元件P-box (gibberellin-responsive element)和GARE-motif (gibberellin-responsive element)分別位于、、、、、、、、、和、、、、、、、、、的啟動子區(qū), 生長素響應(yīng)元件AuxRR-core和TGA-element分別位于、、、和、、、、、、、、、、和的啟動子區(qū)。Xing等[24]分析了31個基因啟動子區(qū)的生長素響應(yīng)元件, 與本文結(jié)果基本吻合。Element B中的分生組織相關(guān)響應(yīng)元件(CAT-box)位于、、、、、、、、、、、、、、、、和的啟動子區(qū), 種子特異調(diào)控響應(yīng)元件(RY-element)分布在、、、和的啟動子區(qū), 生物鐘相關(guān)響應(yīng)元件(circadian)只分布在和的啟動子區(qū), 胚乳表達(dá)相關(guān)元件(GCN4_motif)只分布在和的啟動子區(qū)。Element C中的低溫響應(yīng)元件(low temperature- responsive element, LTR)位于、、、、、、、、、、、、、和的啟動子區(qū), 干旱脅迫響應(yīng)元件(MYB binding site involved in drought-inducibility, MBS)位于、、、、、、、、、、、、、、、和的啟動子區(qū), 防御脅迫響應(yīng)元件(TC-rich repeats)位于、、、、和的啟動子區(qū), 水楊酸響應(yīng)元件(TCA-element)位于、、、、、、、、、和的啟動子區(qū)。其中, 植物激素響應(yīng)相關(guān)順式作用元件最多, 每個基因都含有2~15個; 生長發(fā)育相關(guān)順式作用元件分布在23個基因的啟動子區(qū), 主要包括RY-element、GCN4-motif和circadian等; 逆境脅迫相關(guān)順式作用元件主要分布在29個基因的啟動子區(qū), 主要包括MBS、LTR和TC-rich repeats等。每個基因的啟動子區(qū)都包含多個順式作用元件, 表明玉米基因在植物激素響應(yīng)、生長發(fā)育和逆境脅迫響應(yīng)等方面均發(fā)揮重要作用。

表2 玉米ARF家族基因啟動子區(qū)的順式作用元件

ABRE: 脫落酸響應(yīng)元件; AuxRR-core和TGA-element: 生長素響應(yīng)元件; CGTCA-motif和TGACG-motif: 茉莉酸甲酯響應(yīng)元件; GARE-motif和P-box: 赤霉素響應(yīng)元件; CAT-box: 分生組織相關(guān)響應(yīng)元件; circadian: 生物鐘相關(guān)響應(yīng)元件; GCN4_motif: 胚乳表達(dá)相關(guān)元件;RY-element: 種子特異調(diào)控響應(yīng)元件; LTR: 低溫響應(yīng)元件; MBS: 干旱脅迫響應(yīng)元件; TC-rich repeats: 防御脅迫響應(yīng)元件; TCA-element: 水楊酸響應(yīng)元件。肩標(biāo)數(shù)字代表每個順式作用元件在基因啟動區(qū)的拷貝數(shù)。

ABRE: ABA-responsive element; LTR: low temperature-responsive element; MBS: MYB binding site involved in drought-inducibility. The shoulder number represents the number of copies of each cis-acting element in thegene promoter region.

2.4 玉米ARF家族基因在冷、熱、鹽和滲透脅迫條件下的表達(dá)分析

順式作用元件分析顯示有29個玉米基因啟動子區(qū)包含逆境脅迫相關(guān)順式作用元件。為進(jìn)一步研究玉米家族基因在逆境脅迫響應(yīng)過程中的作用, 我們選取了9個在葉片中表達(dá)量較高的基因(、、、、、、、和), 利用實時定量熒光PCR方法檢測玉米家族基因在冷、熱、鹽及滲透脅迫下的表達(dá)量變化(圖3)。在冷脅迫處理下, 所有被檢測基因的表達(dá)模式都是類似的, 在處理1 h時表達(dá)量迅速上升, 隨后降到較低水平, 處理4 h后又開始上升。在熱脅迫處理下,基因1 h時表達(dá)量達(dá)到峰值, 是未處理時的25倍, 隨后又逐漸下降, 而其余8個基因的表達(dá)量則是隨著時間逐漸上升。在鹽脅迫處理下, 多數(shù)基因的表達(dá)量變化不大(除了在處理4 h時表達(dá)量達(dá)到峰值隨后又開始下降外), 比較有趣的一點是,的表達(dá)量在處理后迅速下降并維持在較低水平, 暗示該基因可能是通過與其他基因相反的途徑參與鹽脅迫調(diào)控過程。在滲透脅迫處理下,、和的表達(dá)量是先上升后下降, 在處理8 h時表達(dá)量達(dá)到峰值;、、和的表達(dá)模式是相似的, 處理1 h時表達(dá)量達(dá)到峰值, 隨后下降并維持在較低水平;和的表達(dá)量變化不大。這些結(jié)果表明,基因涉及參與多種逆境脅迫響應(yīng)過程。

3 討論

作為重要的植物激素, 生長素幾乎參與了植物生長發(fā)育的每個階段。而基因作為生長素響應(yīng)因子, 通過特異性地結(jié)合生長素響應(yīng)元件調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄, 參與諸多植物生長發(fā)育過程[2]。根據(jù)標(biāo)記基因表達(dá)情況可將家族分為3類: 一類(Clade A)具有轉(zhuǎn)錄激活功能, 一類(Clade B)具有轉(zhuǎn)錄抑制功能, 一類(Clade C)既不具有轉(zhuǎn)錄激活功能也不具有轉(zhuǎn)錄抑制功能[25]。這3類基因的功能分類與進(jìn)化關(guān)系是一致的[26]。結(jié)合不同數(shù)據(jù)庫分析得到的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和實時定量PCR結(jié)果可以看出, Clade C主要在幼嫩雄花序中優(yōu)勢表達(dá), 而Clade A和Clade B則主要在幼嫩花序中高水平表達(dá), 有的在幼嫩雌花序中優(yōu)勢表達(dá), 有的在雄花序中優(yōu)勢表達(dá)。不管基因通過轉(zhuǎn)錄激活(Clade A)還是轉(zhuǎn)錄抑制(Clade B), 又或者通過別的調(diào)控途徑(Clade C), 都會通過參與調(diào)控生長素相關(guān)基因影響玉米花序發(fā)育過程。

A: 冷脅迫處理; B: 熱脅迫處理; C: NaCl脅迫處理; D: 滲透脅迫處理。

A: cold stress treatment; B: hot stress treatment; C: NaCl stress treatment; D: osmotic stress treatment.

基因參與了諸多生物學(xué)過程。擬南芥中的突變體花期、葉衰亡和花脫落時間推遲[27], 推測與之同源的玉米和也參與花發(fā)育和葉片發(fā)育, 而這2個基因都在幼嫩花序中優(yōu)勢表達(dá), 也從側(cè)面印證這一推測;參與胚模式建成和維管組織形成[12,28-29], 而作為同源基因的玉米在幼嫩花序和中柱中高表達(dá),在幼嫩花序和果皮中高表達(dá), 這也暗示這2個基因可能參與胚發(fā)育和微管形成;調(diào)控花成熟[16,30], 同源基因玉米和在幼嫩花序和胚中高表達(dá), 可能參與花和果穗形成過程;是果實起始發(fā)育的負(fù)調(diào)控因子[16,30], 黃瓜的同源基因和在單性結(jié)實和非單性結(jié)實品種的表達(dá)差異大[31], 而玉米的同源基因和在幼嫩花序和胚中高表達(dá), 推測參與果穗的發(fā)育和形態(tài)建成。然而玉米基因眾多, 通過DAP-seq測序技術(shù)獲得的順式作用元件分析結(jié)果顯示,基因在Clade A、Clade B和Clade C組間的結(jié)合位點特異性和靶基因等差異不大[32], 暗示基因功能冗余現(xiàn)象嚴(yán)重, 這也是至今還未發(fā)現(xiàn)有表型的玉米突變體的原因[25], 開展功能研究還需新的思路和方法。

隨著玉米基因組測序完成, 高通量測序技術(shù)被廣泛應(yīng)用于基因功能研究。通過分析數(shù)據(jù)庫收錄的測序數(shù)據(jù), 可以獲得不同部位組織器官在不同發(fā)育時期、不同環(huán)境條件下的表達(dá)模式。Liu等[20]通過EST數(shù)據(jù)庫預(yù)測基因主要在雄穗和果穗中表達(dá), Gallavotti等[26]通過數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)分析基因在胚、幼嫩花序和成熟花序中優(yōu)勢表達(dá), 而本文結(jié)合實時定量PCR方法和現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫更新的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析了玉米基因在不同組織器官的表達(dá)模式, 發(fā)現(xiàn)基因主要在雄花序和雌花序中優(yōu)勢表達(dá), 充分說明基因在花序發(fā)育過程中發(fā)揮重要功能。

基因在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮了重要作用, 也參與了許多逆境脅迫響應(yīng)過程。擬南芥參與維管形成, 而干旱條件下植株的維管合成能力加強, 暗示通過參與維管合成而影響植株的抗旱性[6];和通過控制根冠的發(fā)育來影響植株的抗旱性[33]; 大豆基因的表達(dá)量在水分脅迫下發(fā)生明顯變化, 暗示基因參與了大豆水分脅迫響應(yīng)[34]。玉米中的基因在冷、熱、鹽和滲透脅迫處理下, 表達(dá)量均發(fā)生了明顯變化, 這暗示基因參與了玉米多種脅迫響應(yīng)過程。

4 結(jié)論

玉米基因家族的、和呈組成型表達(dá), 其余32個基因均在幼嫩雄花序和雌花序中高表達(dá), 參與了玉米花序發(fā)育過程; 玉米基因家族在冷、熱、鹽和滲透脅迫處理下表達(dá)量發(fā)生明顯變化, 暗示玉米基因家族參與了多種逆境脅迫響應(yīng)過程。

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A study of expression pattern of auxin response factor family genes in maize (L.)

LI Wen-Lan, LI Wen-Cai, SUN Qi, YU Yan-Li, ZHAO Meng, LU Shou-Ping, LI Yan-Jiao, and MENG Zhao-Dong*

Maize Research Institute, Shandong Academy of Agricultural Sciences / National Engineering Laboratory of Wheat and Maize / Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Maize in Northern Yellow-Huai Rivers Plain, Ministry of Agriculture, Jinan 250100, Shandong, China

Auxin response factors (ARFs) are important transcription factors which control the expression of target genes by binding specifically to auxin response elements, and are involved in a series of developmental processes in plant species. In maize genome, dozens ofgenes are encoded, however, there is little known on their expression patterns. In this study, the analysis on the expression level ofgenes in diverse tissues and organs revealed that expression level of 32genes were higher in reproductive organs than that in vegetative organs, except,, andconstitutively expressed. The predicted results of-acting elements showed that the promoter regions of 28genes harbored the-regulatory elements related to abiotic stresses. Real-time quantitative PCR results indicated that expression of severalgenes showed a response to cold, heat, and osmotic stresses, respectively. The results highlighted the importance offamily genes in reproductive growth and abiotic stress response, and provided useful information for the comprehensive analysis of the biological function ofgenes in maize.

auxin response factor; expression; abiotic stress; maize (L.)

10.3724/SP.J.1006.2021.03043

本研究由山東省自然科學(xué)基金項目(ZR2019BC107)資助。

This study was supported by the Natural Science Foundation of Shandong Province (ZR2019BC107).

孟昭東, E-mail: mengzhd@126.com

E-mail: liwenlantutu@126.com

2020-07-07;

2020-11-13;

2020-12-15.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.s.20201214.1748.004.html