一株草甘膦高效降解菌的篩選和表征研究

王天廓，溫玉娟，楊悅鎖，*，路瑩，張茜，曹楠，孫東

（1.吉林大學(xué)地下水資源與環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長春 130021；2.沈陽大學(xué)區(qū)域污染環(huán)境生態(tài)修復(fù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽110044；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)水利與土木工程學(xué)院，哈爾濱 150030；4.四川省地質(zhì)礦產(chǎn)勘查開發(fā)局成都水文地質(zhì)工程地質(zhì)中心，成都610081）

草甘膦[N-（膦酸甲基）甘氨酸]是一種廣譜的系統(tǒng)性除草劑，主要作用于雜草的韌皮部，對雜草中合成蛋白質(zhì)所必需的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶（簡稱為EPSP 合酶）具有顯著的抑制作用，并會(huì)在整個(gè)植物中轉(zhuǎn)移，還會(huì)通過其磷酸基團(tuán)吸附在土壤礦物上[1]。作為除草劑農(nóng)達(dá)（Roundup）的主要成分，草甘膦因具有低成本、高效率除雜草的優(yōu)點(diǎn)而在全世界農(nóng)業(yè)領(lǐng)域得到廣泛使用。美國地質(zhì)勘探局（USGS）在2007 年對采集于全國范圍內(nèi)的1 262 個(gè)地表水樣本和193 個(gè)土壤樣本進(jìn)行了草甘膦殘留量的檢測，結(jié)果表明其中489 個(gè)地表水樣本中有草甘膦的檢出，濃度范圍為 0.02～427.00 μg·kg-1，119 個(gè)土壤樣本中有草甘膦的檢出，其濃度范圍為1.0～476.0 μg·kg-1，同時(shí)在地下水樣本和雨水樣本中也分別有不同程度的草甘膦檢出[2]。草甘膦在土壤和水環(huán)境中的積累，對人類健康以及水土環(huán)境產(chǎn)生諸多負(fù)面影響[3-6]。草甘膦會(huì)在作物的組織中積累，當(dāng)其通過污染作物被人類食用并在體內(nèi)積累到一定含量后即會(huì)危害健康，導(dǎo)致癌癥、慢性腎病、先天性缺陷等[7-9]。2009年P(guān)oulsen等[10]最先提出草甘膦能夠穿透人類胎盤障礙進(jìn)入胎兒室，危害胎兒正常發(fā)育。2009 年Senapati 等[11]首次提出草甘膦會(huì)使人食道、胃和腸道中蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性降低，從而引發(fā)消化系統(tǒng)紊亂，出現(xiàn)腹瀉、過敏等癥狀。2017 年，國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）首次將草甘膦列為人類“可能致癌”物質(zhì)，隨后世界衛(wèi)生組織根據(jù)其結(jié)論，把草甘膦列為“2A 級”致癌物質(zhì)[12]。同時(shí)，草甘膦的積累給土壤和水環(huán)境帶來各種危害[13-15]。2009 年 Valeska 等[16]首次 對比 了 分別 暴露 于草甘膦與其合成制劑農(nóng)達(dá)中的夾雜帶絲蚓，同時(shí)段內(nèi)兩種物質(zhì)都使蠕蟲體內(nèi)抗氧化酶活性顯著提高，結(jié)果表明草甘膦對于土壤生物存在氧化應(yīng)激效應(yīng)。去除草甘膦在水土環(huán)境中的殘留污染已成為當(dāng)下急需解決的問題。

土壤中的草甘膦降解方式主要有水解、光化學(xué)降解、生物降解等[17]，其中生物降解是草甘膦降解的主要途徑。自然界中微生物廣泛存在，尤其在長期施用草甘膦的土壤中會(huì)存在耐受或利用草甘膦的微生物菌群[18]。因此，利用具有草甘膦降解能力的本土微生物進(jìn)行生物修復(fù)是最適合的策略，且生物降解技術(shù)具有低成本、高效、無環(huán)境負(fù)面影響的優(yōu)點(diǎn)[19-21]。近年來利用微生物降解草甘膦的研究得到了越來越多的關(guān)注。Moore 等[22]于1983 年首次篩選出利用草甘膦作為唯一磷源的假單胞菌Pseudomonassp.PG2982，這為篩選草甘膦降解菌的研究奠定了基礎(chǔ)。Fan等[23]首次分離出具有草甘膦降解能力的蠟樣芽孢桿菌，該菌能利用草甘膦為唯一碳源生長。Hadi 等[24]分離篩選出草甘膦降解菌Ochrobactrumsp.GDOS，這是首次報(bào)道的能在60 h 內(nèi)將507 mg·L-1草甘膦完全降解的細(xì)菌，其對于污染水土修復(fù)具有重要意義。Zhao等[25]在中國某除草劑生產(chǎn)廠附近污染土壤中分離得到3株具有草甘膦降解能力的假單胞菌屬細(xì)菌，接種菌的污染土壤相較于未接種土壤的草甘膦去除率提高了2～3 倍，同時(shí)利用一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程對草甘膦降解過程進(jìn)行擬合，但一級反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程并不能反映微生物在生長代謝中受到抑制的過程。利用微生物降解草甘膦（細(xì)菌、真菌、放線菌等）時(shí)，細(xì)菌最有效，并起到最關(guān)鍵的作用，諸多已知的具備降解草甘膦能力的菌種都屬于細(xì)菌，例如Pseudomonassp.、Burkholderiasp.、Arthrobactersp.、Ochrobactrumsp.等[26-30]。

在對降解菌的生物降解動(dòng)力學(xué)研究中，草甘膦可以被認(rèn)為是一種生長抑制化合物，Haldane 方程是表征底物對微生物生長抑制的方程，適用于擬合草甘膦菌株的生長動(dòng)力學(xué)[31]。Nourouzi 等[32]利用 Haldane 方程擬合不同初始濃度、pH、初始接種量下草甘膦在溶液中的生物降解，結(jié)果顯示當(dāng)草甘膦濃度大于500 mg·L-1時(shí)，Haldane 方程擬合的R2值較高（0.942），表明在較高草甘膦初始濃度下，Haldane 模型能夠表征底物的抑制作用。Yan 等[33]在活性污泥中篩選得到草甘膦降解菌Agrobacterium tumefaciensBZ8，并對其降解過程進(jìn)行了Haldane 動(dòng)力學(xué)方程擬合，得到菌株BZ8 的動(dòng)力學(xué)參數(shù)μmax為 1.28 h-1、Ks為 84.82 mg·L-1、Ksi為227.59 mg·L-1（R2=0.99），確定其菌株相應(yīng)的降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)，同時(shí)證明Haldane 方程與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有很強(qiáng)的相關(guān)性。

在以往對草甘膦微生物修復(fù)的研究報(bào)道中，利用劍菌降解草甘膦同時(shí)優(yōu)化其最佳培養(yǎng)條件的研究尚未出現(xiàn)，并且目前還沒有報(bào)道使用Haldane 方程擬合劍菌菌株降解草甘膦的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。本研究通過分離篩選實(shí)驗(yàn)獲取了一株具有草甘膦降解能力的劍菌菌株Ensifersp.BRY，并利用16s rDNA 序列分析手段對其進(jìn)行了菌種鑒定。通過探究該細(xì)菌最佳降解條件（pH、草甘膦初始濃度、接種量、外加碳源）以獲得最大的生物降解性能，并利用Haldane 降解動(dòng)力學(xué)模型首次擬合劍菌菌株對草甘膦的降解過程，確定其降解動(dòng)力學(xué)參數(shù)，優(yōu)化降解菌的培養(yǎng)條件，為劍菌菌株用于含草甘膦農(nóng)藥的生物降解提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

98.2%草甘膦原藥購買于百靈威科技有限公司，瓊脂購于索萊寶生化試劑公司，其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

以草甘膦為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基，每1 L 蒸餾水中組分構(gòu)成：MgSO4·7H2O 0.500 g、K2HPO4·3H2O 1.310 g、FeSO4·7H2O 0.018 g、NaNO33.000 g。外加200 mg·L-1草甘膦用于培養(yǎng)和分離草甘膦降解菌株。

主要儀器包括高壓蒸汽滅菌鍋（日本TOMY/SX-500），離子色譜儀（瑞士萬通/930 Compact），紫外分光光度計(jì)（Hitachi/U-2910），恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城/ZWYR-2102C），生化培養(yǎng)箱（上海智城/ZXSDB1090），超凈工作臺(tái)（安泰/SW-CJ-2FD），Milli-Q 超純水系統(tǒng)（默克）。

1.2 草甘膦降解菌的富集與分離

供試土壤取自遼寧省沈陽市沈北新區(qū)前進(jìn)農(nóng)場土壤（123°31′29″～123°31′55″E，41°04′50″～42°05′10″N），該區(qū)長期施用多種復(fù)合農(nóng)藥。土樣200 g 取自0～15 cm土層，自然陰干后儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

取10 g土樣和100 mL基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基于250 mL錐形瓶中，外加50 mg·L-1草甘膦，在30 ℃、150 r·min-1的條件下振蕩培養(yǎng)3 d，取10 mL 上層懸浮液加入到100 mL 新鮮基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，外加100 mg·L-1草甘膦，在同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)，第3 個(gè)周期以后固定外加200 mg·L-1草甘膦，并在相同條件下培養(yǎng)。自第4個(gè)周期起，在液體培養(yǎng)基中蘸取適量培養(yǎng)液涂布于基礎(chǔ)鹽固體培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上，其中基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基以草甘膦為唯一碳源，在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，待菌落長出后，用接種環(huán)在分離較好的單一菌落上沾取少量菌體涂抹于以草甘膦為唯一碳源的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基平板上，倒置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，如此反復(fù)，經(jīng)過13 個(gè)周期，直到平板上長出的所有菌落形狀和大小相近。

1.3 細(xì)菌的鑒定和系統(tǒng)發(fā)育分析

利用高通量測序?qū)Y選得到的菌株進(jìn)行菌種分類學(xué)鑒定，通過PCR 通用引物對菌株的16S rDNA 進(jìn)行基因序列擴(kuò)增，正向引物為27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ ，反 向 引 物 為 1492R：5′ -AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，擴(kuò)增反應(yīng)體積50 μL，反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)染色劑染色后凝膠成像，將產(chǎn)物于-80 ℃保存。在The EzBioCloud database（www.ezbiocloud.net）對BRY進(jìn)行序列比對分析，將所得結(jié)果利用MEGA10.0 軟件中的Neighbor-Joining（NJ）方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 菌株BRY的降解特性

挑取適量BRY 菌落接種于200 mg·L-1草甘膦基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r·min-1條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期后離心（10 000 r·min-1，10 min），去上清，使用磷酸鹽緩沖溶液對沉淀菌體進(jìn)行反復(fù)沖洗兩次后重懸，調(diào)節(jié)菌懸液OD600值為0.2，采用稀釋涂布平板法測得此時(shí)菌液細(xì)胞濃度約為1.4×107cfu·mL-1。通過每次改變一種培養(yǎng)條件，來探究菌株BRY 的生長特性。

以10%的接種量接種BRY 至不同pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，pH 調(diào)節(jié)使用1 mol·L-1HCl 溶液和 1 mol·L-1NaOH 溶液）的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，并設(shè)置草甘膦濃度為100 mg·L-1，放置于30 ℃、150 r·min-1的搖床中，自 0 h 起，每隔 4 h 取 8 mL 樣品，經(jīng) 0.22 μm 濾膜過濾后，使用離子色譜法[34]測定草甘膦濃度，儀器參數(shù)設(shè)置：淋洗液 為 8 mmol·L-1的 Na2CO3；抑制 系 統(tǒng)為0.5%H2SO4+超純水；流速為0.7 mL·min-1；進(jìn)樣體積為20 μL；柱溫308 K；泵壓9.9 MPa；色譜運(yùn)行時(shí)間31.0 min；保留時(shí)間25.0～26.0 min，該方法檢測范圍為0.1～100.0 mg·L-1。同時(shí)利用紫外分光光度計(jì)測定菌液OD600值，以考察菌株在不同pH 條件下的生長情況。草甘膦降解率計(jì)算公式：

式中：Q為草甘膦降解率，%；C0為草甘膦的初始濃度，mg·L-1；Ct為培養(yǎng)結(jié)束后培養(yǎng)基中殘留的草甘膦濃度，mg·L-1。

為研究BRY對污染物草甘膦的耐受能力，以10%的接種量接種BRY至不同濃度（50、100、200、300、400 mg·L-1）草甘膦基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，放置于30 ℃、150 r·min-1的搖床中，自0 h起，每隔4 h取8 mL樣品，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，利用離子色譜測定草甘膦濃度，同時(shí)利用紫外分光光度計(jì)測定菌液OD600值。

為研究接種量對降解速率的影響，以1%、5%、10%、20%、30%的接種量接種BRY至200 mg·L-1草甘膦基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，放置于30 ℃、150 r·min-1的搖床中，自0 h起，每隔4 h取8 mL樣品，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，利用離子色譜測定草甘膦濃度，同時(shí)利用紫外分光光度計(jì)測定菌液OD600值。

為研究BRY 在有其他碳源的影響下對草甘膦的利用能力，選取單糖（葡萄糖0.5 g·L-1）和雙糖（蔗糖0.5 g·L-1）加入到200 mg·L-1草甘膦基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中，另設(shè)不外加碳源的草甘膦基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基作為對照。其中BRY 接種量為10%，在30 ℃、150 r·min-1的搖床中培養(yǎng)，自0 h起，每隔4 h取8 mL樣品，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，測定溶液pH值，利用離子色譜測定草甘膦濃度，同時(shí)利用紫外分光光度計(jì)測定菌液OD600值。

1.5 菌株對草甘膦的降解動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)

Monod 動(dòng)力學(xué)模型是最常用來描述微生物生長的動(dòng)力學(xué)模型，但當(dāng)體系含有抑制性底物時(shí)Monod模型并不適用。Haldane 模型在Monod 模型基礎(chǔ)上開發(fā)，目前已經(jīng)被廣泛用于表征底物對微生物的生長抑制[35]。因此本研究采用Haldane方程來描述菌株BRY的生長動(dòng)力學(xué)。對于不同初始濃度草甘膦的反應(yīng)體系，菌株比生長速率用如下公式計(jì)算：

式中：μ為菌體的比生長速率，h-1；μmax為最大比細(xì)胞生長速率，h-1；ρs為草甘膦初始濃度，mg·L-1；Ks為半飽和常數(shù)，mg·L-1；Ksi為抑制常數(shù)，mg·L-1。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株BRY的分子生物學(xué)鑒定

以 BRY 的總 DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增 16s rDNA 序列，16S rDNA 長度為 1 363 bp。將 BRY 的 16S rDNA擴(kuò)增序列在The EzBioCloud database 上做序列比對分析，結(jié)果表明其與Ensifer morelensis模式菌株Lc04（GenBank 登錄號(hào) AY024335）的 16S rDNA 基因序列相似性達(dá)到99.48%。根據(jù)BRY 的16S rDNA 序列與其相關(guān)種屬16S rDNA 序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹（圖1）可知，菌株 BRY 與Ensifer morelensis進(jìn)化關(guān)系最近，并與多株Ensifersp.型菌株聚在一個(gè)支持良好的分支上，因此確定菌株BRY 歸屬于劍菌屬（Ensifersp.）。模式菌株Ensifer morelensisLc04 最早由 Wang 等[36]在2002 年提出，該菌株為革蘭氏陰性菌，無芽孢，桿狀，好氧，能以廣泛的碳水化合物和氨基酸作為唯一碳源生長，并且除dl-丙氨酸和尿素外，大多數(shù)氨基酸可以作為其生長的唯一氮源，同時(shí)對羧芐青霉素、卡那霉素、紅霉素等抗生素具有多重耐藥性。

2.2 菌株BRY的最佳降解條件

2.2.1 pH對菌株BRY降解草甘膦的影響

微生物生長體系中pH的變化會(huì)通過影響細(xì)胞膜所帶電荷而改變細(xì)胞對外界物質(zhì)的吸收，偏酸性或偏堿性的環(huán)境條件均會(huì)影響生物酶的活性，主要表現(xiàn)在細(xì)胞膜電荷的變化以及蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子所帶電荷的變化[37]。細(xì)菌的生長狀況會(huì)直接影響對污染物的降解率[38]。pH 對菌株BRY 降解草甘膦能力的影響如圖2 所示，可以看出pH 對菌株BRY 的降解率影響較大，在50 h 培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，菌株BRY 在pH 5.0 時(shí)的草甘膦降解率為79.36%，在pH 6.0 時(shí)達(dá)到最高降解率91.93%，在pH 為7.0、8.0、9.0 時(shí)的降解率逐漸下降，分別為60.02%、57.18%、54.32%。草甘膦屬于酸性除草劑，長期過量使用會(huì)導(dǎo)致土壤酸化，影響土壤中的生物轉(zhuǎn)化[39]。一些草甘膦降解菌從長期施用草甘膦的農(nóng)田土壤中分離篩選出來后，都在偏酸性的條件下展現(xiàn)出更強(qiáng)的降解能力。Fan 等[23]對降解菌Bacillus cereusCB4 降解草甘膦的pH 條件的研究結(jié)果表明，在pH 6.0時(shí)草甘膦降解率最高，并且隨著pH的增大降解率逐漸下降。張慧芳等[40]分離篩選得到的菌株Burkholderia vietnamiensisB-1 和假單胞菌屬Pseudomonassp.Y-1 均在pH 6.0 條件下達(dá)到最佳降解能力，認(rèn)為弱酸性條件下降解酶活性較高。Sun 等[41]對固氮細(xì)菌Ensifer meliloti及其腈水合酶（NHase）降解新煙堿類殺蟲劑的特性研究中表明，NHase在pH 6.0～9.0條件下保存12 h 后，活性仍保留在93%以上，其中在pH 6.0條件下，NHase活性保持最高。因此推測pH 6.0更有助于提高菌株BRY的草甘膦降解酶的活性?？傮w而言，Ensifersp.BRY在pH 6.0時(shí)的降解效果最佳。

2.2.2 菌株BRY對不同濃度草甘膦的降解能力

當(dāng)微生物培養(yǎng)體系中草甘膦濃度發(fā)生變化時(shí)，細(xì)菌的生長狀況也會(huì)受到影響，草甘膦的生物毒性隨著其濃度的增大而增大，研究細(xì)菌對不同濃度草甘膦的降解程度是評價(jià)其降解能力的主要標(biāo)準(zhǔn)之一[42]。菌株BRY 對不同濃度草甘膦的降解能力見圖3。總體上，同時(shí)間內(nèi)菌株的生長量隨著草甘膦濃度的增大而有所減少，當(dāng)草甘膦初始濃度為100、200、300 mg·L-1時(shí)，同時(shí)間內(nèi)菌株OD600值相差較小，說明在這一濃度范圍內(nèi)草甘膦對菌株BRY 的生長影響較小。50 h內(nèi)，在草甘膦濃度為 50、100、200、300、400 mg·L-1時(shí)的降解率分別為53.39%、60.64%、62.52%、69.60%、40.01%，表明Ensifersp.BRY 能夠在以草甘膦為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，可以耐受最高400 mg·L-1的草甘膦，并在此濃度下具有一定降解能力。在不同初始濃度草甘膦溶液中，同時(shí)間內(nèi)菌株BRY 在300 mg·L-1草甘膦培養(yǎng)基中降解率最高。降解過程在50 h 左右趨于平穩(wěn)，因此在實(shí)際場地修復(fù)過程中，菌株BRY 應(yīng)至少在土壤中停留50 h以上才能達(dá)到較佳修復(fù)效果。

2.2.3 不同初始接種量對菌株BRY 降解草甘膦能力的影響

初始接種量是直接影響草甘膦降解菌降解的影響因素，一定程度上增加細(xì)菌初始接種量可以提高降解速率、減少生長延遲時(shí)間[43]。研究不同初始接種量對菌株BRY 降解草甘膦速率的影響，以此確定菌株BRY 對草甘膦的最佳降解條件。不同初始接種量對菌株BRY 降解草甘膦能力的影響見圖4。24 h 內(nèi)，在初始接種量為1%、5%、10%、20%和30%時(shí)的草甘膦降解率分別為 7.52%、15.57%、14.89%、40.06% 和26.80%?？傮w上，從經(jīng)濟(jì)成本以及修復(fù)效率考慮，20%接種量是草甘膦降解的最佳接種量，在8 h 內(nèi)草甘膦降解菌的降解率可達(dá)到40.06%，并在72 h 達(dá)到完全降解。

2.3 外加碳源對菌株BRY降解草甘膦能力的影響

蔗糖和葡萄糖均屬于容易被微生物利用的外加碳源，葡萄糖屬單糖，蔗糖是由果糖和葡萄糖構(gòu)成的雙糖。在微生物降解過程中，如培養(yǎng)體系中含有多種碳源時(shí)，會(huì)優(yōu)先消耗葡萄糖和蔗糖這類速效碳源，因此參與利用的其他碳源的酶系合成會(huì)受到抑制，這一現(xiàn)象稱為碳源阻遏效應(yīng)[44]。因此分別用葡萄糖和果糖作為外加碳源加入培養(yǎng)體系中，以探究外加碳源對菌株BRY 降解草甘膦能力的影響，其結(jié)果如圖5 所示。由結(jié)果可知，外加葡萄糖和蔗糖都明顯促進(jìn)了菌株BRY的生長，在30 ℃、起始pH 7.96、150 r·min-1時(shí)，對照中草甘膦降解率較高，加入葡萄糖和果糖都會(huì)使草甘膦降解率下降，因?yàn)樵谔荚醋瓒粜?yīng)的影響下，菌株BRY 會(huì)優(yōu)先代謝消耗葡萄糖和蔗糖。在培養(yǎng)過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測溶液pH 變化，結(jié)果如圖6，顯示外加碳源的兩種體系pH均升高，由于降解過程中pH的升高間接導(dǎo)致了草甘膦降解率的降低。

2.4 菌株BRY的降解動(dòng)力學(xué)

微生物在不同濃度污染物質(zhì)中的比生長速率（μ）由指數(shù)生長期決定，是根據(jù)指數(shù)生長期的菌體細(xì)胞干質(zhì)量和時(shí)間的半對數(shù)圖繪制線性最小二乘擬合得到，在指數(shù)生長期可以認(rèn)為比生長速率為一個(gè)常數(shù)[45]。菌體比生長速率的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與Haldane 模型擬合結(jié)果如圖7 所示。結(jié)果表明，初始濃度由0 mg·L-1增加到100 mg·L-1時(shí)，菌體的比生長速率隨著初始草甘膦濃度的增加而增大；初始濃度由100 mg·L-1增加到400 mg·L-1時(shí)，比生長速率隨草甘膦濃度的增加而顯著下降，呈現(xiàn)出由于底物濃度增加導(dǎo)致的菌體生長受到抑制現(xiàn)象。通過實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)確定Haldane 方程參數(shù)，并且利用Origin 2018軟件進(jìn)行非線性曲線擬合，得到以草甘膦為唯一碳源的培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株BRY 的Haldane 參數(shù)，μmax為 1.68 h-1，Ks為 167.80 mg·L-1，Ksi為50.55 mg·L-1，Ksi/Ks=0.30，相關(guān)系數(shù)R2=0.99，擬合情況良好。Ksi為50.55 mg·L-1，說明該菌株的草甘膦抑制濃度為50.55 mg·L-1，并且用Haldane 方程描述菌株BRY 降解過程是合理的。通過表1 中生長動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果對比可以看出BRY 具有較高的降解率和μmax值，說明將Ensifersp.BRY 應(yīng)用于實(shí)際修復(fù)草甘膦污染具有較高的可行性和使用前景。

3 結(jié)論

（1）通過富集培養(yǎng)法在遼寧省沈陽市沈北新區(qū)某農(nóng)田土壤中分離得到一株草甘膦高效降解菌株Ensifersp.BRY，其能夠在以草甘膦為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長。

表1 不同草甘膦降解菌生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)對比Table 1 Comparative list of glyphosate-degrading bacteria growth due to Haldane′s model

（2）微生物修復(fù)的研究結(jié)果表明，草甘膦降解菌Ensifersp.BRY 對草甘膦的耐受能力最高達(dá)400 mg·L-1，其對草甘膦的去除率與初始草甘膦濃度有較大關(guān)系。30 ℃、pH 6.0、150 r·min-1、初始接種量為20%為最佳降解條件，在體系中外加碳源（葡萄糖、蔗糖，0.5 g·L-1）會(huì)促進(jìn)Ensifersp.BRY的生長，但會(huì)降低其對草甘膦的利用率。Ensifersp.BRY在含100 mg·L-1草甘膦的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中50 h內(nèi)降解率為91.93%，降解過程較短，在一定程度上提高了修復(fù)效率。

（3）Ensifersp.BRY 降解過程符合 Haldane 方程，μmax為 1.68 h-1，Ks為 167.80 mg·L-1，Ksi為 50.55 mg·L-1，由擬合結(jié)果可知當(dāng)濃度高于50.55 mg·L-1時(shí)降解速率開始下降，出現(xiàn)抑制模式。