茶樹籽蛋白質(zhì)微波輔助酶解制備多肽的研究

鄭德勇 陳成聰 顏陽蕾 張潔婷 葉乃興

(福建農(nóng)林大學(xué)材料工程學(xué)院1，福州 350002)(國家茶葉質(zhì)量安全工程技術(shù)研究中心2，泉州 350000)(福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院；茶學(xué)福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室3，福州 350002)

中國是茶(Camelliasinensis(L.)O.Ktze.)的原產(chǎn)地。種植茶樹主要為生產(chǎn)茶葉，其副產(chǎn)物茶樹籽的產(chǎn)量因品種、樹齡、栽培技術(shù)等因素而有很大差異[1,2]。據(jù)《2017中國茶業(yè)年鑒》，2016年全國18個產(chǎn)茶省份茶園面積為290.2萬hm2、開采茶園面積220.4萬hm2，茶樹籽產(chǎn)量十分可觀。茶與油茶(CamelliaoleiferaAbel.)同是山茶屬(CamelliaL.)的植物，油茶籽油是富含油酸、角鯊烯等功能成分的特種食用木本植物油，我國已有油茶林面積450 萬hm2、年產(chǎn)油茶籽油約60萬t；茶樹籽資源的開發(fā)利用剛剛開始，研究表明，不同品種茶樹籽含油脂17.77%～38.39%[3,4]，茶樹籽油是富含油酸、亞油酸、亞麻酸和二十二碳六烯酸(DHA)的高品質(zhì)油脂[5]。目前雖有茶樹籽油產(chǎn)品面市[6]，但約占茶樹籽質(zhì)量80%的提取殘渣未得到有效利用，使茶樹籽資源的價值不能充分展現(xiàn)。

生物活性肽大都具有對人體有益的生物學(xué)特性，以及易吸收、生物利用度高的優(yōu)點(diǎn)，是極具發(fā)展前景的功能因子[7-10]。有關(guān)油茶籽粕提取多肽及其功能活性的研究大量見諸文獻(xiàn)[11-18]，茶樹籽粕的開發(fā)利用也受到關(guān)注，學(xué)者深入研究了茶樹籽淀粉[19-21]、蛋白質(zhì)[22-24]的提取工藝和酶解產(chǎn)物的抗氧化能力等[25,26]。然而，植物體內(nèi)游離的多肽物質(zhì)通常含量很低，目前較為有效的途徑是提取蛋白質(zhì)再經(jīng)酶解實(shí)現(xiàn)批量制備，但酶解時間通常須達(dá)數(shù)小時，生產(chǎn)效率較低，利用微波輔助酶解技術(shù)，可將蛋白質(zhì)酶解時間縮短至15 min以內(nèi)[27-30]。以微波為加熱源和促酶手段，研究茶樹籽蛋白質(zhì)酶解制備多肽工藝，可為茶樹籽粕的高效利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

茶樹籽采集于福建農(nóng)林大學(xué)實(shí)驗(yàn)茶園，風(fēng)干備用。氫氧化鈉、鹽酸、硫酸銅、三氟乙酸和茚三酮均為國藥集團(tuán)的AR試劑，胃蛋白酶、絡(luò)蛋白磷酸肽(CPP)、牛血清蛋白(BAS)為生物試劑。

1.2 茶樹籽蛋白質(zhì)與多肽的制備方法

1.2.1 茶樹籽蛋白質(zhì)的提取

參考陸晨等[31]方法，并改良部分操作。取200 g茶樹籽仁破碎，用2 000 mL正己烷分3次浸漬、提取油脂，殘渣蒸發(fā)溶劑、晾干，得脫脂茶樹籽粕，用于茶樹籽蛋白質(zhì)提取。取100 g 脫脂茶樹籽粕于2 000 mL燒杯中，加入1 000 mL蒸餾水室溫下浸漬6 h，開啟攪拌，用10% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至10.0，在45 ℃水浴中處理80 min，每隔20 min測pH值、并調(diào)節(jié)至10.0。靜置30 min，傾出浸提液，5 000 r/min離心15 min，棄沉淀物；取上清液調(diào)節(jié)用10% HCl溶液調(diào)pH至4.3，在45 ℃水浴中處理80 min，5 000 r/min離心15 min，棄上清液。取出沉淀物，加入蒸餾水洗滌、離心，重復(fù)操作4次至溶液呈中性，得到沉淀物。沉淀物冷凍、在冷凍干燥機(jī)干燥，得到茶樹籽粗蛋白粉。

1.2.2 微波酶解法制備茶樹籽多肽

取0.6 g茶樹籽粗蛋白粉于100 mL燒瓶中，加入20 mL蒸餾水、攪拌，配制30.0 g/L的茶樹籽粗蛋白溶液，加熱到 90 ℃、并保持20 min后冷卻至室溫，備用。按試驗(yàn)設(shè)計的條件，用10% HCl溶液調(diào)pH，將燒瓶放入超聲-微波協(xié)同萃取儀中進(jìn)行處理，微波功率為700 W，酶解結(jié)束后迅速加熱到90 ℃、保持5 min滅酶，再冷卻至室溫，水解液6 000 r/min離心20 min，合并上層清液，測定其茶樹籽蛋白質(zhì)水解度和水解液的多肽濃度。

1.3 茶樹籽蛋白質(zhì)微波酶解工藝優(yōu)化試驗(yàn)方案

1.3.1 微波酶解工藝的單因素試驗(yàn)

采用單因素試驗(yàn)考察胃蛋白酶用量、酶解溫度、酶解時間和酶解液pH值等工藝因子對茶樹籽蛋白質(zhì)微波酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)水解度和水解液多肽濃度的影響。即：固定條件為蛋白酶用量6 000 u/g、酶解液pH 2.5、酶解時間6 min，酶解溫度分別設(shè)定為35、40、45、50、55 ℃；固定條件為蛋白酶用量6 000 u/g、酶解溫度為45 ℃、酶解時間6 min，分別調(diào)節(jié)酶解液pH值為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5；固定條件為蛋白酶用量6 000 u/g、酶解溫度為45 ℃、酶解液pH2.5，微波酶解時間分別設(shè)定為3、6、9、12、15 min；固定條件為pH 2.5、酶解溫度45 ℃、酶解時間6 min，胃蛋白酶用量分別為3 000、4 000、5 000、6 000、7 000、8 000 u/g。

1.3.2 微波酶解工藝的優(yōu)化試驗(yàn)

以胃蛋白酶用量、酶解溫度、酶解時間和酶解液pH值為實(shí)驗(yàn)因素，選用正交表L16(44)安排工藝優(yōu)化試驗(yàn)(表1)。以茶樹籽蛋白質(zhì)水解度和產(chǎn)物多肽濃度為指標(biāo)，分析確定優(yōu)化工藝條件。

表1 酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計表

1.4 茶樹籽蛋白質(zhì)水解度和多肽濃度的測定方法

采用改進(jìn)的茚三酮比色法[32]測定茶樹籽蛋白質(zhì)的水解度。采用改進(jìn)的三氯乙酸沉淀雙縮脲比色法[33]測定酶解產(chǎn)物茶樹籽多肽的濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹籽蛋白質(zhì)微波酶解工藝單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 胃蛋白酶用量的影響

由圖1可知，胃蛋白酶用量對茶樹籽蛋白質(zhì)水解度和產(chǎn)物多肽濃度具有相似的影響，其隨胃蛋白酶用量的增加逐漸提高；當(dāng)胃蛋白酶用量低于6 000 u/g，隨著胃蛋白酶用量的增大，茶樹籽蛋白水解度和產(chǎn)物多肽濃度均呈近線性快速上升趨勢，繼續(xù)增大胃蛋白酶用量至8 000 u/g，可能由于胃蛋白酶已經(jīng)達(dá)到飽和，其增加值很小。由圖1可知，6 000～8 000 u/g是較優(yōu)胃蛋白酶用量工藝條件。

圖1 茶樹籽蛋白質(zhì)水解度和水解液多肽濃度與胃蛋白酶用量的關(guān)系

2.1.2 微波酶解溫度的影響

由圖2可知，微波酶解溫度對茶樹籽蛋白質(zhì)水解度和產(chǎn)物多肽濃度具有相似的影響，在35～50 ℃范圍內(nèi)隨水解溫度的升高、茶樹籽蛋白水解度和產(chǎn)物多肽濃度的提高速率較快，并在50 ℃達(dá)到最高值；在55 ℃下微波酶解的茶樹籽蛋白質(zhì)水解度和產(chǎn)物多肽濃度均顯著降低。這是由于胃蛋白酶對茶樹籽蛋白的水解有“最高耐受溫度”，高于此溫度時、酶的活性受到抑制，而低于這個溫度時、酶的活性隨溫度的升高而提高。

圖2 茶樹籽蛋白質(zhì)水解度和水解液多肽濃度與微波酶解溫度的關(guān)系

2.1.3 微波酶解時間的影響

由圖3可知，微波酶解時間對茶樹籽蛋白質(zhì)水解度和產(chǎn)物多肽濃度具有相似的影響，其隨酶解時間延長逐漸提高；酶解時間由3 min提高到6 min，茶樹籽蛋白水解度和產(chǎn)物多肽濃度提高了近1倍，但在酶解時間達(dá)到9 min之后其增長速率減少，可以考慮在酶解工藝優(yōu)化中將酶解時間的中值設(shè)定在12～15 min。

圖3 茶樹籽蛋白質(zhì)水解度和水解液多肽濃度與微波酶解時間的關(guān)系

2.1.4 酶解液pH的影響

由圖4可知，酶解液pH值對茶樹籽蛋白質(zhì)水解度和產(chǎn)物多肽濃度具有相似的影響，由pH 1.5提高到pH 3.5，茶樹籽蛋白水解度和產(chǎn)物多肽濃度均呈上升趨勢，其中前期上升速率較大、后期速率明顯下降，并在pH 3.5達(dá)到最高值；當(dāng)pH大于3.5后，茶樹籽蛋白水解度和產(chǎn)物多肽濃度均迅速下降，說明胃蛋白酶在茶樹籽蛋白質(zhì)微波水解體系中的“最適pH”為pH 3.5。這與胃蛋白酶一般最適pH在2.0左右存在明顯差異，這可能由于酶解是一個連續(xù)變化的過程，酶解液的實(shí)際pH值也可能隨之變化；也可能由于微波處理極大加快了酶解進(jìn)程，導(dǎo)致微波環(huán)境下胃蛋白酶對pH的敏感性(或最佳pH)發(fā)生顯著變化；還可能由于茶樹籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為pH 3.6[22]，高于pH 4.0時其在水中的溶解度降低，阻礙酶水解進(jìn)程。

圖4 茶樹籽蛋白質(zhì)水解度和水解液多肽濃度與酶解液pH的關(guān)系

2.2 茶樹籽蛋白質(zhì)微波酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2.1 茶樹籽蛋白質(zhì)水解度工藝優(yōu)化條件的確定

表2為茶樹籽蛋白質(zhì)微波酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果。

表2 茶樹籽蛋白質(zhì)微波酶解工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，影響茶樹籽蛋白質(zhì)水解度的工藝因素主次順序?yàn)镈>B>C>A，最優(yōu)水平分別為A3、B3、C4、D3，即茶樹籽蛋白質(zhì)水解度的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件為：胃蛋白酶用量6 000 u/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間15 min、酶解液pH值3.5。

表3 茶樹籽蛋白質(zhì)水解度正交試驗(yàn)表

2.2.2 酶解液多肽濃度優(yōu)化條件的確定

由表4可知，影響酶解液多肽濃度工藝因素的主次順序?yàn)镈>B>C>A，最優(yōu)水平分別為A3、B3、C4、D3，即水解液多肽濃度的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化條件為：胃蛋白酶用量6 000 u/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間15 min、酶解pH值3.5。

表4 水解液多肽濃度正交實(shí)驗(yàn)K值表

2.3 茶樹籽蛋白質(zhì)微波酶解制備多肽最優(yōu)工藝條件的確定與驗(yàn)證

綜合茶樹籽蛋白質(zhì)水解度和水解液多肽濃度正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析，茶樹籽蛋白質(zhì)微波酶解制備多肽的最優(yōu)工藝條件確定為：胃蛋白酶用量6 000 u/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間15 min、酶解液pH值3.5。依最優(yōu)工藝進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，并與水浴加熱酶解處理和水浴加熱4 h的結(jié)果作為對照比較(表5)。

由表5可知，在最優(yōu)工藝條件下，茶樹籽蛋白質(zhì)微波酶解的產(chǎn)物中蛋白質(zhì)水解度和水解液多肽濃度分別為13.65%和13.18 g/L，均高于單因素實(shí)驗(yàn)和正交實(shí)驗(yàn)的最好結(jié)果，表明工藝的優(yōu)化有效。表5的結(jié)果也顯示，水浴加熱酶解4 h的水解度接近微波酶解15 min的效果，說明微波酶解工藝可顯著縮短蛋白質(zhì)酶解進(jìn)程、提高酶解液中多肽的含量。

微波酶解是茶樹籽蛋白質(zhì)分子中的肽鍵被酶的催化作用切斷、生成分子質(zhì)量較小的多肽的過程，在適宜條件下，增加胃蛋白酶用量、延長酶解時間，能提高蛋白質(zhì)的水解度和產(chǎn)物中多肽濃度。根據(jù)蛋白質(zhì)水解度定義，說明在本研究的優(yōu)化工藝條件下，每個茶樹籽蛋白質(zhì)分子中平均有7.3個肽鍵發(fā)生了降解，產(chǎn)物溶液中多肽的濃度為底物蛋白質(zhì)濃度(30.0 g/L)的43.93%，取得了較好的效果。在“最佳溫度”和“最佳pH值”條件下，進(jìn)一步增加胃蛋白酶用量會因催化劑飽和問題而效果不顯，而延長酶解時間，原理上應(yīng)該能提高蛋白質(zhì)的水解度，但同時應(yīng)注意到多肽也可在此條件下進(jìn)一步水解為氨基酸，產(chǎn)物溶液的多肽濃度會在達(dá)到一個峰值后反而因降解為氨基酸而降低，過度延長酶解時間還會降解生產(chǎn)效率，可見，控制酶解反應(yīng)時間是必要的。

3 結(jié)論

影響茶樹籽蛋白質(zhì)微波輔助酶解制備多肽的蛋白質(zhì)水解度和酶解液多肽濃度工藝因素的主次順序均為D>B>C>A，其最優(yōu)工藝條件確定為：胃蛋白酶用量6 000 u/g、酶解溫度50 ℃、酶解時間15 min、酶解液pH值3.5。在最優(yōu)工藝條件下茶樹籽微波酶解產(chǎn)物的蛋白質(zhì)水解度為13.65%、產(chǎn)物的多肽濃度為13.18 g/L。