安陽(yáng)地區(qū)副豬嗜血桿菌分離株的耐藥性與耐藥基因檢測(cè)

王慶云

(安陽(yáng)市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南安陽(yáng) 455000)

副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，Hps)是養(yǎng)豬業(yè)中重要的細(xì)菌性傳染病病原之一，在美國(guó)、英國(guó)、澳大利亞等多個(gè)國(guó)家及我國(guó)多個(gè)地區(qū)普遍流行，在發(fā)病過程中，經(jīng)常與豬藍(lán)耳病、豬圓環(huán)病毒病混合感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。副豬嗜血桿菌對(duì)各個(gè)年齡段具有易感性，主要侵害4周齡～8周齡仔豬，臨床中主要表現(xiàn)為纖維素性胸膜炎、關(guān)節(jié)炎及腦膜炎等多種癥狀，仔豬病死率可達(dá)50%以上[3-4]。臨床中Hps可以分為15個(gè)血清型，近幾年分離的菌株未能鑒定出血清型，且不同的地區(qū)流行的血清不同，各種血清型的Hps沒有完全交叉保護(hù)性[5-6]?？股亻L(zhǎng)期不合理使用導(dǎo)致副豬嗜血桿菌的耐藥性，耐藥基因是細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要因素[7-8]。 本試驗(yàn)從安陽(yáng)地區(qū)養(yǎng)殖場(chǎng)采集患病豬的肺臟、肝臟、關(guān)節(jié)滲出液等病料組織157份，分離得到了102株副豬嗜血桿菌，對(duì)分離菌株進(jìn)行耐藥性和耐藥基因檢測(cè)，為該地區(qū)副豬嗜血桿菌的防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 2019年3月至6月，采集安陽(yáng)地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)中患病仔豬的肺臟、肝臟、關(guān)節(jié)滲出液等病料組織157份。

1.1.2 主要試劑 巧克力培養(yǎng)基、70 mL/L綿羊血培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)，均購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司；生化試紙條、藥敏紙片，均購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；2×TaqMarker Mix購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；DNA Marker DL 1 000購(gòu)自北京中科瑞泰生物公司。

1.1.3 儀器設(shè)備 多功能梯度PCR儀，美國(guó)ABI公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)伯樂公司產(chǎn)品；恒溫培養(yǎng)箱和恒溫水浴鍋，上海恒一科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離與鑒定 采集患病豬的肺臟、肝臟、關(guān)節(jié)滲出液等病料組織放入無菌采集管(無菌的PBS)，無菌條件下接種于70 mL/L綿羊血培養(yǎng)基上，在37℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h～24 h，挑取單個(gè)菌落巧克力培養(yǎng)基上，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h～36 h，挑取巧克力培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落在TSB進(jìn)行純化培養(yǎng)后，革蘭氏染色、鏡檢觀察其形態(tài)學(xué)。

1.2.2 生化鑒定 按照生化試劑的說明書將分離菌株接種于生化試劑管中，37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h～36 h后，進(jìn)行生化鑒定。

1.2.3 分離菌株的PCR鑒定 參考文獻(xiàn)[4]，設(shè)計(jì)副豬嗜血桿菌16S rRNA鑒定引物 P1：5′-GTGATGAGGAAGGGTGGT-3′，P2：5′-GGCTTCGTCACCCTCTGT-3′。目的基因片段821 bp，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。用水煮法提取分離菌株的DNA基因組，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增， 其PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄參考株進(jìn)行同源性分析。

1.2.4 細(xì)菌的藥敏試驗(yàn) 參照美國(guó)臨床檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)(NCCLS)推薦的標(biāo)準(zhǔn)KB紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，按照CLSI的標(biāo)準(zhǔn)判斷耐藥(R)、敏感(S)或中介(I)進(jìn)行耐藥性結(jié)果判斷。

1.2.5 細(xì)菌的耐藥基因檢測(cè) 參考文獻(xiàn)[9-10]，設(shè)計(jì)β-內(nèi)酰胺類4種耐藥基因(TEM、SHV、OXA、DHA)，磺胺類2種耐藥基因(SulⅠ、SulⅡ)，四環(huán)素類2種(TetA、TetB)，酰胺醇類(氟苯尼考)1種耐藥基因folR，大環(huán)內(nèi)酯類2種耐藥基因(ermA、ermB)，林可酰胺類耐藥基因lnu(C)，喹諾酮類4種耐藥基因(gyrA、gyrB、qnrA、qnrB)等16種耐藥基因。用1.2.3制備基因DNA為模板，用梯度PCR進(jìn)行耐藥基因檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離與培養(yǎng)結(jié)果

疑似副豬嗜血桿菌在70 mL/L綿羊血培養(yǎng)基上長(zhǎng)出邊緣整齊的、圓形的、灰白色菌落；在巧克力培養(yǎng)基上長(zhǎng)出表面光滑的、圓形的、隆起的、整齊的、灰白半透明的菌落。革蘭氏染色鏡檢結(jié)果，分離菌株呈革蘭氏陰性，為桿狀、短桿狀等多形性形態(tài)。

2.2 細(xì)菌生化鑒定結(jié)果

分離菌株接觸酶試驗(yàn)呈陽(yáng)性，脲酶、氧化酶、鳥氨酸脫氫酶、吲哚試驗(yàn)均呈陰性，能分解果糖、蔗糖、葡萄糖、半乳糖、麥芽糖和阿拉伯糖；不分解甘露醇；為陰性。102株分離菌株初步鑒定為副豬嗜血桿菌。

2.3 細(xì)菌PCR鑒定結(jié)果

分離的102株菌株用副豬嗜血桿菌16S rRNA引物均擴(kuò)增出約為821 bp的目的基因(圖1)。測(cè)序結(jié)果顯示，分離菌株的測(cè)序結(jié)果與GenBank庫(kù)中登錄的副豬嗜血桿菌參考株基因序列的同源性為97%～99%。說明分離的102株菌株為副豬嗜血桿菌。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 1 000 ；1～9.分離菌株M.DNA Marker DL 1 000；1-9.Isolated strains

2.4 細(xì)菌耐藥性結(jié)果

臨床分離的102株副豬嗜血桿菌對(duì)14種抗菌藥物產(chǎn)生不同的耐藥性。對(duì)青霉素、阿莫西林、慶大霉素、紅霉素、大觀霉素、多黏菌素、磺胺間甲氧嘧啶7種藥物耐藥性最高，耐藥率90.2%～98.0%；對(duì)替米考星林可霉素、氟苯尼考3種藥物耐藥率44.1%～56.9%；對(duì)頭孢噻呋、頭孢噻肟、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、林可霉素4種藥物耐藥率較低，耐藥率9.8%～26.5%(表1)。 分離株呈現(xiàn)多重耐藥性，耐14種藥物有2株、耐13、7種藥物各6株、耐12、5種藥物各7株、 耐11種藥物有18株、耐10種藥物有22株、耐9種藥物有21種、耐8種藥物有21株、耐8種藥物有9種、 耐6種藥物有4株。其中耐11、10、9種藥物菌株最多，分別占分離菌株的17.6%、21.6%、20.6%(表2)。

表1副豬嗜血桿菌分離株的耐藥性檢測(cè)結(jié)果

2.5 細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

分離菌株攜帶10種不同的耐藥基因，耐藥基因TetA、TetB、floR、ermA、lnu(C)檢出率較高，檢出率41.2%～85.3%，耐藥基因TEM、SHV、DHA、gyrA、gyrB檢出率11.8%～13.7%，耐藥基因OXA、ermB、qnrA、qnrB未檢出(表3)。

3 討論

副豬嗜血桿菌是一種條件致病菌，當(dāng)外界環(huán)境改變時(shí)可導(dǎo)致豬的抵抗力降低，可以誘發(fā)感染其他病原菌。該菌主要通過飛沫、空氣、直接接觸及排泄物等多種途徑傳播，引起豬呼吸道疾病，嚴(yán)重者直接引起患豬死亡，是臨床中常見的危害養(yǎng)豬業(yè)的主要病原菌之一[11-12]。

表2副豬嗜血桿菌分離株多重耐藥結(jié)果

表3副豬嗜血桿菌分離株耐藥基因檢測(cè)結(jié)果

副豬嗜血桿菌具有多種血清型，不同血清型缺乏完全交叉免疫性，由于目前沒有有效疫苗預(yù)防副豬嗜血桿菌，抗生素成為防治該病的主要手段之一，隨著抗生素的使用，逐漸產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性[13]。本試驗(yàn)從安陽(yáng)地區(qū)分離的102株副豬嗜血桿菌對(duì)青霉素、阿莫西林、慶大霉素等10種的耐藥率44.1%以上，其他藥物的耐藥率為9.8%～26.5%，耐11、10、9種藥物菌株最多，分別占分離菌株的17.6%、21.6%、20.6%。說明從安陽(yáng)地區(qū)分離的副豬嗜血桿菌對(duì)常用的抗菌藥產(chǎn)生很強(qiáng)的耐藥性，且呈現(xiàn)多重耐藥性。魏海林[6]報(bào)道了從四川地區(qū)分離的副豬嗜血桿菌對(duì)常用藥物耐藥情況嚴(yán)重，92.95%菌株至少對(duì)2種抗菌藥物耐藥。余仁等[4]報(bào)道的湖南地區(qū)分離副豬嗜血桿菌對(duì)阿莫西林和林肯霉素的耐藥較強(qiáng)。從屠宰場(chǎng)中分離的3株副豬嗜血桿菌對(duì)青霉素、林可霉素和甲氧芐啶等抗菌藥物耐藥[8]。與本試驗(yàn)與上述報(bào)道的具有一定差異性，可能與地區(qū)和抗生素使用情況有關(guān)。在發(fā)生該病時(shí)應(yīng)該合理使用抗菌藥物，減少耐藥性產(chǎn)生，提高治療效果。

副豬嗜血桿菌耐藥性的產(chǎn)生不僅與使用抗菌藥物的頻率有關(guān)，還有攜帶的耐藥基因有關(guān)，在外界抗生素選擇的壓力下，其耐藥機(jī)制發(fā)生改變引起耐藥性，耐藥基因是作為細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的重要影響因素之一[8-11]。本試驗(yàn)表明，分離的102株副豬嗜血桿菌耐藥基因TetA、TetB、floR、ermA、lnu(C)檢出率41.2%～85.3%，其他耐藥基因檢出率11.8%～13.7%，說明分離菌株攜帶多種耐藥基因。攜帶的耐藥基因介導(dǎo)副豬嗜血桿菌耐藥性機(jī)理尚未明確，有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果可為該地區(qū)的副豬嗜血桿菌病的防控提供科學(xué)依據(jù)。