醋柴胡多糖VBCP-3的結(jié)構(gòu)和抗炎作用研究

黃賢能，萬 鵬，趙瑞芝，胡巧紅*

(1.廣東藥科大學(xué) 藥學(xué)院，廣東廣州 510006；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東廣州 510006)

柴胡為傘形科植物柴胡(BupleurumchinenseDC)或狹葉柴胡的干燥根，分別習(xí)稱為“北柴胡”及“南柴胡”，具有疏散退熱、疏肝解郁、升舉陽氣的功效[1]?，F(xiàn)代藥理研究表明柴胡具有解熱鎮(zhèn)痛、保肝、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、抗?jié)儭⒖拱┑榷喾N藥理作用[2-4]。柴胡的主要成分包括皂苷、揮發(fā)油以及多糖[5-6]。柴胡多糖具有抗炎、增強(qiáng)免疫功能和抗腫瘤等活性[7-8]。醋炙是柴胡的常見炮制方法，而柴胡醋炙后，柴胡多糖是否具有抗炎活性，目前鮮有報(bào)道。本研究通過脫脂、水提醇沉、脫蛋白和陰離子交換柱層析等方法對(duì)醋柴胡多糖進(jìn)行分離純化獲得精制多糖并用LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞RAW264.7制備細(xì)胞炎癥模型，探討醋柴胡多糖對(duì)LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥材 醋柴胡(產(chǎn)地為湖北，批號(hào)：201706)，經(jīng)廣東省中醫(yī)院陳文良藥師鑒定為傘形科植物北柴胡干燥根醋制品,康美藥業(yè)有限公司。

1.1.2 試劑 乙酸酐(批號(hào)：20131102),廣州化學(xué)試劑廠；鹽酸羥胺(批號(hào)：H811236),廣州菲博生物有限公司；DEAE-FF瓊脂糖凝膠(批號(hào)：R16F8D29299),上海源葉生物有限公司； Dextran 855K、Dextran 215K、Dextran 130K、Dextran 60K、Dextran 40K、Dextran 18K(批號(hào)分別為：230-F、91418、98841、40KA、R4、95F),北京綠百草有限公司；甘露糖(批號(hào)：AA0416LA13)、鼠李糖(批號(hào)：S29D5G1)、阿拉伯糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：AJ0702FA14)、巖藻糖(批號(hào)：A31M7L155555；)、D-無水葡萄糖(批號(hào)：Y01D5Y3)、木糖(批號(hào)：B02M6W1)、半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)：YM0506YA14)均為上海源葉生物科技有限公司，純度≥99%；地塞米松磷酸鈉注射液(DXMS，國藥準(zhǔn)字12020515)，天津金耀集團(tuán)湖北天藥藥業(yè)股份有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基(批號(hào)：20171014)，Gibco公司；MTT試劑(批號(hào)：DH343-1)，廣州威佳生物有限公司；二甲基亞砜(CP，批號(hào)：201703)，廣州化學(xué)試劑廠；一氧化氮試劑盒(批號(hào)：S0021)，碧云天生物科技有限公司。

1.1.3 細(xì)胞 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW 264.7，購于上海ATCC細(xì)胞庫。

1.1.4 主要儀器 氣相質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀(7890A/5975C)，美國安捷倫公司；高效液相色譜儀(1260)，美國安捷倫公司；傅里葉變換紅外光譜儀(Vector 33)，德國Bruck公司 ；紫外分光光度計(jì)(UV-2900)，日本日立公司；酶標(biāo)儀(VICTOR X5型)PerkinElmer公司；倒置顯微鏡(CKX41)，日本Olympus公司；自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(ZC-1000)，上海睿鈺生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 醋柴胡多糖的提取純化

1.2.1.1 醋柴胡總多糖的提取和分離 根據(jù)文獻(xiàn)工藝進(jìn)行多糖提取和分離[9]。8 kg醋柴胡藥材用700 mL/L乙醇冷浸過夜后，用5倍體積的700 mL/L乙醇加熱回流提取4次，過濾。藥渣用10倍體積水回流提取3次，過濾，減壓濃縮至相當(dāng)于生藥量1 mg/mL，得醋柴胡水提液。醋柴胡水提液中加入乙醇，調(diào)節(jié)含醇量為80%，于4℃靜置過夜。抽濾，收集沉淀，凍干得醋柴胡粗多糖。將醋柴胡粗多糖用Sevage法脫蛋白7次，減壓濃縮除去有機(jī)溶劑后再次調(diào)節(jié)含醇量為80%，離心后收集沉淀，凍干得到醋柴胡總多糖。

1.2.1.2 醋柴胡精多糖的制備 稱取800 mg醋柴胡總多糖，溶于20 mL純水。以DEAE瓊脂糖凝膠Fast flow離子交換層析柱(26×800 mm)進(jìn)行分離純化。分別用水、0.05、0.1、0.2、0.4、1 mol/L的NaCl溶液和0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液以3 mL/min進(jìn)行洗脫，每管收集10 mL，以苯酚硫酸法進(jìn)行隔管檢測，作出洗脫曲線，收集0.2 mol/L NaCl溶液洗脫組分，減壓濃縮，透析72 h后凍干，得到醋柴胡精多糖，命名為VBCP-3。

1.2.2 醋柴胡多糖VBCP-3的結(jié)構(gòu)分析

1.2.2.1 VBCP-3的紫外光譜掃描 精密稱取VBCP-3 5 mg，用超純水配制為500 mg/L溶液。以超純水為空白對(duì)照，利用紫外分光光度計(jì)在190 nm～550 nm范圍進(jìn)行全波長掃描。

1.2.2.2 VBCP-3的純度與分子量測定 以葡聚糖D18K、D40K、D60K、D130K、D215K、D855K為標(biāo)準(zhǔn)品，分別將不同質(zhì)量的葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品和VBCP-3配制成 2.0 mg/mL的溶液，過0.22 μm濾膜，以安捷倫高效液相1260檢測。色譜柱為TSK G-4000PWXL，進(jìn)樣量為 20 μL，流動(dòng)相為超純水，流速為0.5 mL/min，柱溫40℃，檢測器為示差折光檢測器，檢測器溫度為40℃。記錄色譜圖和保留時(shí)間，用標(biāo)準(zhǔn)品葡聚糖相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)lg(Mw)對(duì)保留時(shí)間作圖，得到葡聚糖相對(duì)分子量分布標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)方程，通過相對(duì)分子量方程計(jì)算VBCP-3的分子質(zhì)量。

1.2.2.3 VBCP-3的紅外光譜分析 稱取VBCP-3 2 mg，干燥條件下壓成薄片，于500 cm-1～4 000 cm-1進(jìn)行常規(guī)IR分析。

1.2.2.4 VBCP-3的單糖組成分析 稱取VBCP-3 10 mg，加入2 mol/L的三氟乙酸溶液4 mL，110℃加熱6 h，將水解樣品于50℃減壓濃縮蒸干，加入適量體積甲醇重復(fù)減壓濃縮，去除殘留的三氟乙酸。

取 10 mg VBCP-3水解產(chǎn)物，加入10 mg鹽酸羥胺、1 mL吡啶，于 90℃水浴加熱30 min，加入乙酸酐1 mL，再于90℃繼續(xù)水浴加熱30 min，反應(yīng)結(jié)束后冷卻至室溫，過0.22 μm濾膜后進(jìn)行 GC-MS分析，與標(biāo)準(zhǔn)單糖比對(duì)分析單糖組成及比例。

色譜條件：Agilent 7890A-5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀；Agilent HP-5MS毛細(xì)管柱(0.25 μm×250 μm，30 m)；汽化室溫度 250℃，檢測器溫度 250℃，柱溫 150℃；程序升溫：150℃(2 min)→200℃(3 min)→250℃(10 min)；載氣流速：1 mL/min；吹掃：4.0 mL/min。

1.2.3 醋柴胡多糖VBCP-3的抗炎活性

1.2.3.1 RAW 264.7細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠腹腔巨噬細(xì)胞(RAW 264.7)復(fù)蘇，加入完全培養(yǎng)基離心棄上清之后，再次加入新的完全培養(yǎng)基反復(fù)吹打，分別加入到2個(gè)培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿再次加入5 mL完全培養(yǎng)基，然后置于37℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.3.2 VBCP-3對(duì)細(xì)胞存活率的影響 將細(xì)胞RAW264.7接種于96孔板上(200 μL/孔)。置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，吸棄上清液，加入200 μL含不同濃度VBCP-3的細(xì)胞培養(yǎng)液(VBCP-3濃度分別為500、250、125、62.5、31.3、15.6、7.8、3.9 mg/L)。24 h后取出，用MTT法測定各組的細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率(%)=給藥組平均吸光度/空白對(duì)照組平均吸光度×100%

1.2.3.3 VBCP-3對(duì)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO的影響 將3×105個(gè)/mL RAW264.7細(xì)胞加入24孔板(1 mL/孔)，培養(yǎng)24 h后，棄去上清，分為空白培養(yǎng)液組、LPS組(1 mg/L LPS)、陽性藥物組(1 mg/L LPS+50 mg/L地塞米松)、VBCP-3組(1 mg/L LPS+(7.8～125) mg/L VBCP-3溶液)，每組加入對(duì)應(yīng)的供試液(或空白培養(yǎng)液)1 mL。培養(yǎng)24 h后，按照試劑盒說明操作。將1 mol/L NaNO2標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成0、1.62、3.12、6.25、12.5、25、50、100 μmol/L的NaNO2溶液，然后取50 μL不同濃度的NaNO2稀釋液，置于96孔板上，加入50 μL試劑1，再加入50 μL試劑2，放置5 min后，用酶標(biāo)儀測定540 nm處的吸光度并做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。給藥樣品取上清液50 μL，按照上述方法測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中NO的含量。NO抑制率(%)=(1-給藥組NO含量/LPS組NO含量)×100%

1.2.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行正態(tài)性分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)各組NO 抑制率進(jìn)行比較，以P<0.01表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 醋柴胡多糖VBCP-3的提取與純化

醋柴胡采用700 mL/L乙醇脫脂，經(jīng)過熱水提取，水提醇沉，Sevage法脫蛋白后，得到醋柴胡總多糖。通過DEAE-FF陰離子交換柱以不同濃度洗脫劑洗脫(圖1)，獲得不同的組分，其中0.2 mol/L NaCl溶液洗脫得到醋柴胡精多糖，命名為VBCP-3。

圖1VBCP-3的DEAE-FF陰離子交換層析洗脫曲線圖

2.2 醋柴胡多糖VBCP-3的結(jié)構(gòu)

通過紫外分光度計(jì)全波長掃描可知， VBCP-3在260 nm和280 nm處無明顯吸收峰，提示醋柴胡多糖VBCP-3不含核酸和蛋白質(zhì)。以葡聚糖D18K、D40K、D60K、D215K、D855K為標(biāo)準(zhǔn)品繪制多糖分子量測定的標(biāo)準(zhǔn)曲線，求得線性回歸方程為：t=-4.781 1×lg(Mw)+39.42(R2=0.9965)。醋柴胡多糖VBCP-3峰寬較窄，分布均一，其分子質(zhì)量為436.221 ku(圖2)。

VBCP-3的紅外圖譜(圖3)顯示其具有多糖的一般結(jié)構(gòu)特征，在3 300.11 cm-1處有寬而鈍的吸收，是O-H的伸縮振動(dòng)峰，2942.8 cm-1處是C-H伸縮振動(dòng)峰，1 594.30 cm-1處是-CHO的C=O的伸縮振動(dòng)峰，在1 100 cm-1～1 010 cm-1附近有3個(gè)吸收峰，提示VBCP-3為吡喃糖。通過與標(biāo)準(zhǔn)單糖比對(duì)，并通過峰面積計(jì)算可知，VBCP-3的單糖組成及摩爾比為鼠李糖∶阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖=1.3∶24.9∶3.2∶1.00(圖4、圖5)。

2.3 醋柴胡多糖VBCP-3的抗炎活性

醋柴胡多糖VBCP-3對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖的影響見圖6，VBCP-3在3.9 mg/L～125 mg/L范圍內(nèi)存活率均在80%以上，說明在該范圍內(nèi)VBCP-3對(duì)RAW264.7細(xì)胞無明顯毒性，故可在3.9 mg/L～125 mg/L范圍內(nèi)選取合適濃度進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

圖2VBCP-3分子量色譜圖

圖3VBCP-3的紅外光譜圖

以LPS誘導(dǎo)RAW 264.7細(xì)胞，產(chǎn)生炎癥因子，根據(jù)Griess法測定NO的釋放量，考察待測藥物對(duì)細(xì)胞炎癥的影響。NO在0～100 μmol/L范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.003 9x+0.040 6(R2=0.999 8)。與正常組相比，經(jīng)LPS刺激后，細(xì)胞產(chǎn)生大量的NO(P<0.01)；陽性藥物地塞米松顯著抑制NO釋放(P<0.01)，其抑制率為70.07%，說明炎癥模型造模成功。與模型組相比，含量7.8 mg/L～125 mg/L的醋柴胡多糖VBCP-3能顯著抑制炎癥因子NO的釋放，其中7.8、31.25、125 mg/L的VBCP-3的NO抑制率分別為44.18%、74.34%和86.53%(P<0.01)，抑制效果隨VBCP-3濃度增大而增強(qiáng)。與陽性藥物地塞米松相比，125 mg/L的VBCP-3多糖具有顯著的抗炎作用(P<0.01)(圖7)。

3 討論

柴胡多糖具有抗炎、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等作用，文獻(xiàn)報(bào)道柴胡醋炙后抗炎作用減弱，疏肝解郁、減肥、降血脂等作用增強(qiáng)，而且能增加與其配伍藥物在肝臟的分布[10-11]，而醋制后柴胡多糖是否具有抗炎活性，目前少有報(bào)道。 本文從醋柴胡中提取、分離得到多糖VBCP-3，并對(duì)其結(jié)構(gòu)及活性的進(jìn)行初步探討。結(jié)果顯示得到的VBCP-3為吡喃糖，分子質(zhì)量為436.221 ku，單糖組成及摩爾比為鼠李糖∶阿拉伯糖∶半乳糖∶葡萄糖=1.3∶24.9∶3.2∶1.00，屬于中性雜多糖。VBCP-3的單糖組成和分子質(zhì)量與文獻(xiàn)已知的柴胡多糖均不同[12-13]，為新發(fā)現(xiàn)的多糖。

圖4單糖組成混合標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖

1.鼠李糖；2.阿拉伯糖；3.葡萄糖；4.半乳糖1.Rhamnose; 2.Arabinose; 3.Glucose; 4.Galactose

圖6不同濃度VBCP-3的細(xì)胞存活率(n=3)

與空白組比較：**P<0.01；與模型組比較：##P<0.01；與陽性藥物組比較，++P<0.01；+表示含有該物質(zhì)，-表示不含該物質(zhì)

一氧化氮(NO)在心血管、消化、免疫、呼吸等系統(tǒng)的調(diào)節(jié)中具有廣泛的病理生理作用，被普遍認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)傳導(dǎo)信號(hào)的第二信使。正常狀態(tài)下，細(xì)胞NO含量很少。LPS為細(xì)菌等物質(zhì)含有的多糖，是常見的致炎因子，當(dāng)細(xì)胞被LPS等物質(zhì)刺激時(shí)，大量的 NO 被誘導(dǎo)表達(dá)進(jìn)而介導(dǎo)炎癥等疾病的發(fā)生與發(fā)展，NO含量可以作為炎癥反應(yīng)程度的指標(biāo)[14]。小鼠巨噬細(xì)胞在受LPS刺激后可以產(chǎn)生NO，柴胡多糖能顯著降低LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌NO的水平(P<0.01)，80 mg/L柴胡多糖溶液的NO抑制率為22.22%[15]。而本研究顯示7.8 mg/L～125 mg/L濃度范圍的醋柴胡多糖VBCP-3能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞分泌NO(P<0.01)，其中31.25 mg/L濃度VBCP-3的NO抑制率為74.34%，高于文獻(xiàn)。提示VBCP-3對(duì)NO的抑制作用大于柴胡多糖，柴胡醋制后多糖仍具抗炎活性。本研究提取分離出分子質(zhì)量為436.221 ku、均一的醋柴胡精多糖VBCP-3，能夠抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7的NO分泌量，表明醋柴胡多糖也具有抗炎活性，有良好的應(yīng)用潛力，但其抗炎作用的機(jī)制有待進(jìn)一步探討與論證。