羊源腐生葡萄球菌的鑒定及生物學(xué)特性分析

向 益，王 利，魏 勇，張 樺

(1.西南民族大學(xué)青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部和四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610041；2.四川省畜牧科學(xué)研究院獸醫(yī)研究所，四川成都 610041)

腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)是一種革蘭氏陽(yáng)性、凝固酶陰性、非溶血性球菌[1]。腐生葡萄球菌可以引發(fā)急性膀胱炎、腎盂腎炎[2]、心內(nèi)膜炎[3]、結(jié)膜炎[4]、乳腺炎等病癥，同時(shí)也可引起傷口感染及水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)。此外，腐生葡萄球菌可作為馬飼料添加劑，減少馬糞溫室氣體的排放[5]；能高效處理高鹽堿性三苯甲胺類(lèi)廢水；能在發(fā)酵肉制品的制作中發(fā)揮作用。近年來(lái)，腐生葡萄球菌已成為醫(yī)源性感染的常見(jiàn)病原菌，并隨著抗生素的濫用，導(dǎo)致腐生葡萄球菌具有多重耐藥的趨勢(shì)。目前已從魚(yú)類(lèi)、奶牛、腌肉制品、人胃腸道等中被分離鑒定腐生葡萄球菌，但未見(jiàn)從羊中分離到腐生葡萄球菌的報(bào)道。四川某羊場(chǎng)羊只突發(fā)死亡，從心臟中分離培養(yǎng)得到1株腐生葡萄球菌，命名為S.S QJ-01，對(duì)其進(jìn)行常規(guī)鑒定及分子生物學(xué)鑒定以及藥敏試驗(yàn)，旨在為該菌的后續(xù)研究提供指導(dǎo)，為該菌引起的疾病的防治提供科學(xué)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 四川某羊場(chǎng)突發(fā)死亡病羊，其體型消瘦，眼、鼻均有白色滲出物，剖檢發(fā)現(xiàn)其肝臟、腎臟腫大、充血，心臟表面有出血點(diǎn)。無(wú)菌采集心臟、肝臟、腎臟作為細(xì)菌分離的病料。

1.1.2 主要試劑 LB固體培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基和Mueller-hinton agar培養(yǎng)基均購(gòu)自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司；1.1×T3 Super PCR Mix、DNA Marker DL 2 000、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司；16種葡萄球菌常用生化鑒定管和藥敏紙片均購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)革蘭氏染色試劑盒購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 主要儀器 電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自Bio-Rad公司；PCR儀購(gòu)自Eppendorf Germany公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌分離及形態(tài)觀察 無(wú)菌接種環(huán)采集病羊心臟、肝臟、腎臟樣品，劃線接種于LB固體培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)20 h，挑取單菌落于平板純化3次，挑取顏色、形狀相近的單菌落經(jīng)3次液體LB肉湯培養(yǎng)基傳代后用50%甘油保種備用。進(jìn)行革蘭氏染色鑒定，用草酸銨結(jié)晶紫初染、碘液媒染、950 mL/L乙醇脫色、番紅染色液復(fù)染，干燥后于光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄。

1.2.2 生理生化 鑒定參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》(第八版)[1]中細(xì)菌鑒定的方法，采用細(xì)菌微量生化鑒定管對(duì)待測(cè)菌株S.S QJ-01進(jìn)行各項(xiàng)生化指標(biāo)的測(cè)定，并利用杭州微生物試劑有限公司提供的《葡萄球菌生化鑒定編碼冊(cè)》對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。

1.2.3 引物的設(shè)計(jì)與合成 參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)細(xì)菌16S rDNA基因引物、aac(6′)-Ⅰb和aac(3)-Ⅱa氨基糖苷類(lèi)抗生素耐藥基因引物、Sul1、Sul2和Sul3磺胺類(lèi)抗生素耐藥基因引物、TEMβ-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥基因引物。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.4 細(xì)菌基因組DNA提取 按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取菌株S.S QJ-01的總DNA，其濃度及質(zhì)量于紫外分光光度計(jì)檢測(cè)合格后(D260nm/D280nm=1.8-2.0),置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 16S rDNA基因PCR擴(kuò)增及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建 采用16S rDNA基因引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增條件為：98℃ 2 min；98℃ 10 s，55℃ 10 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，于凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果并拍照。PCR產(chǎn)物由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序拼接。將測(cè)序結(jié)果與已知GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中核苷酸序列進(jìn)行Blast比對(duì)，通過(guò)Neihbor-Joining方法，構(gòu)建菌株S.S QJ-01的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。采用MEGA6.0軟件對(duì)以上序列進(jìn)行同源性分析。

1.2.6 小鼠致病性試驗(yàn) 從四川省成都市中醫(yī)藥研究所購(gòu)買(mǎi)健康昆明雌鼠10只，體重約為25 g～28 g，正常飼喂7 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組和試驗(yàn)組，每組5只。將接種于LB肉湯液體培養(yǎng)基的菌株S.S QJ-01置于37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h，隨后12 000 r/min離心5 min收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水清洗2次，制備成濃度為1×108CFU/mL的菌懸液。用無(wú)菌注射器抽取0.2 mL的菌懸液，對(duì)小鼠進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組注射等量的無(wú)菌生理鹽水，每隔2 h觀察記錄，對(duì)死亡小鼠進(jìn)行剖檢，并對(duì)其體內(nèi)病原菌進(jìn)行分離鑒定。取其肺、肝、腎、脾臟樣品經(jīng)40 g/L多聚甲醛固定，制備成組織切片，經(jīng)HE染色后，在光學(xué)顯微鏡下觀察病理變化。對(duì)照組小鼠于第7天處死，取相應(yīng)臟器制作組織切片。

1.2.7 耐藥基因檢測(cè) 以提取的菌株S.S QJ-01總DNA為模板，PCR擴(kuò)增各種耐藥基因。PCR擴(kuò)增條件為：98℃ 2 min；98℃ 10 s，50℃～65℃ 15 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸2 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，于凝膠成像系統(tǒng)觀察耐藥基因擴(kuò)增條帶是否與目的條帶一致。

1.2.8 藥敏試驗(yàn) 采用K-B紙片法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，參照中華人民共和國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《紙片法抗菌藥物敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)(WS/T 125-1999)》及美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)標(biāo)準(zhǔn)與指南判定結(jié)果。將保種的菌株S.S QJ-01接種于滅菌生理鹽水中，調(diào)整菌液濃度為0.5麥?zhǔn)蠁挝?。取少量菌液均勻涂布于MH瓊脂平板，將藥敏片緊貼在平板表面，于35℃培養(yǎng)20 h后測(cè)定抑菌圈直徑。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離及形態(tài)觀察

菌株S.S QJ-01在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)20 h后，形成不透明、圓形凸起、邊緣整齊、乳白色小菌落。革蘭氏染色鏡檢，菌株S.S QJ-01被染成紫色，形態(tài)為球狀，串狀排列，表明菌株S.S QJ-01為革蘭氏陽(yáng)性菌。

2.2 細(xì)菌生化鑒定

菌株S.S QJ-01能發(fā)酵蔗糖、蕈糖、乳糖、果糖、麥芽糖、甘露醇、N-乙酰葡萄糖胺；不發(fā)酵甘露糖、蜜二糖、木糖、山梨醇、木糖醇。尿素酶試驗(yàn)、乙酰甲基甲醇試驗(yàn)(V-P)、甲基紅試驗(yàn)(MR)陽(yáng)性；精氨酸雙水解酶試驗(yàn)陰性，不還原硝酸鹽。結(jié)果顯示，該菌株與腐生葡萄球菌具有相似的生化特性。

2.3 細(xì)菌16S rDNA鑒定

菌株S.S QJ-01的16S rDNA基因經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得1 465 bp的片段，與預(yù)期相符(圖1)。采用Blast將測(cè)序拼接后的菌株S.S QJ-01 16S rDNA基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示，菌株S.S QJ-01與腐生葡萄球菌ATCC15305菌株同源性為99.50 %，與腐生葡萄球菌GTC843菌株同源性為98.10 %。在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中菌株S.S QJ-01與腐生葡萄球菌GTC843菌株位于同一分支(圖2)。因此，綜合形態(tài)學(xué)觀察及分子生物學(xué)鑒定，可判定菌株S.S QJ-01為腐生葡萄球菌。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1～2.菌株S.S QJ-01 16S rDNA擴(kuò)增產(chǎn)物

圖2菌株S.S QJ-01的16S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.4 小鼠致病性試驗(yàn)

菌株S.S QJ-01感染小鼠8 h后，試驗(yàn)組小鼠出現(xiàn)精神沉郁、食欲不振、被毛凌亂、弓背等癥狀，12 h后，試驗(yàn)組小鼠開(kāi)始死亡。對(duì)死亡小鼠進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，結(jié)果表明分離的致病菌為腐生葡萄球菌。剖檢可見(jiàn)死亡小鼠肺臟充血、出血；肝臟呈暗紅色、充血；脾臟淤血呈黑色；心臟和腎臟未見(jiàn)明顯病理變化。對(duì)照組小鼠未見(jiàn)異常變化。組織切片顯示，肺泡壁毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血，肺泡壁充滿紅細(xì)胞(圖3A)；肝細(xì)胞變性，肝竇擴(kuò)張、充血，中央靜脈充血，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3B)；腎小球萎縮、充血，腎小管上皮細(xì)胞壞死、核固縮、甚至消失，管腔狹窄(圖3C)；脾臟紅髓區(qū)充滿大量紅細(xì)胞，淀粉樣變性(圖3D)。表明菌株S.S QJ-01具有較強(qiáng)致病性。

A.肺臟；B.肝臟；C.腎臟；D.脾臟A.Lung; B.Liver; C.Kidney; D.Spleen

2.5 耐藥基因檢測(cè)

菌株S.S QJ-01的耐藥基因PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，β-內(nèi)酰胺類(lèi)TEM耐藥基因陽(yáng)性，大小約為719 bp；氨基糖苷類(lèi)aac(6′)-Ⅰb耐藥基因陽(yáng)性，大小約為486 bp，氨基糖苷類(lèi)aac(3)-Ⅱa耐藥基因陽(yáng)性，大小約為384 bp；磺胺類(lèi)耐藥基因中Sul2耐藥基因陽(yáng)性，大小約為793 bp，Sul1和Sul3耐藥基因陰性(圖4)。

M.DNA 標(biāo)準(zhǔn) DL 2 000；1.TEM 基因; 2.aac(6′)-Ⅰb基因; 3.aac(3)-Ⅱa基因；4.Sul1基因; 5.Sul2基因; 6.Sul3基因 7.陰性對(duì)照

2.6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)菌株S.S QJ-01進(jìn)行抗生素敏感性檢測(cè)，結(jié)果顯示其對(duì)頭孢唑林、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明、慶大霉素、多西環(huán)素、氟苯尼考等12種抗生素敏感；對(duì)青霉素、克林霉素、多黏菌素E等7種抗生素耐藥(表1)。

3 討論

腐生葡萄球菌作為一種條件致病菌，廣泛存在自然界中，在特定條件下可引起人和動(dòng)物感染發(fā)病。目前，已分別從狐貍[7]、雞肉[8]、腐敗鯧魚(yú)、土壤[9]中分離鑒定出腐生葡萄球菌。腐生葡萄球菌作為泌尿生殖道感染的常見(jiàn)病原菌，還常從生殖道樣本中被分離。在引起人和動(dòng)物疾病方面僅有少量報(bào)道，該菌能引起人腎盂腎炎[2]、兒童下呼吸道感染、奶牛乳腺炎。此外，該菌還可引起人結(jié)膜炎、心內(nèi)膜炎等病癥。Hiroki M[3]等報(bào)道了人下消化道感染腐生葡萄球菌引起菌血癥并發(fā)急性心內(nèi)膜炎的病例，并在血液中分離到了腐生葡萄球菌。說(shuō)明該菌主要通過(guò)血液系統(tǒng)在動(dòng)物機(jī)體內(nèi)傳播，導(dǎo)致各器官急性轉(zhuǎn)移性感染，這也可能成為試驗(yàn)小鼠急性死亡的原因。本研究從湖羊中分離鑒定出腐生葡萄球菌菌株S.S QJ-01，該菌株主要引起小鼠肺部炎癥以及脾臟炎癥，心臟的病變并不明顯。這可能是由于不同菌株和宿主感染部位的不同所致。所以，在臨床中應(yīng)注意感染方式的不同對(duì)動(dòng)物各臟器造成的損害程度有所差異。

表1菌株S.S QJ-01的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

耐藥基因在各物種間廣泛傳播，使細(xì)菌產(chǎn)生多重耐藥，研究細(xì)菌的耐藥基因有助于理解耐藥表型與基因型的關(guān)系，并為臨床藥物的使用提供參考。TEM基因?qū)儆诔瑥V譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)基因，含有β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌可以解開(kāi)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素中的β-內(nèi)酰胺環(huán)，使抗生素失效。氨基糖苷耐藥的方式主要以酶修飾失活為主，干擾抗生素與核糖酰-tRNA親和力降低，使抗生素失活[10]?；前奉?lèi)抗生素(SAs)的耐藥機(jī)制是產(chǎn)生低親和力的二氫葉酸合成酶，從而降低細(xì)菌對(duì)磺胺類(lèi)藥物的敏感性。TEM耐藥基因已在魚(yú)源哈維弧菌[11]和雞源致病性大腸埃希氏菌中被檢出。aac(6′)-Ⅰb和aac(3)-Ⅱa耐藥基因已在人源肺炎克雷伯菌[12]、水貂銅綠假單胞菌中被檢出。Sul2耐藥基因已在狐貂源大腸埃希氏菌[13]和魚(yú)源門(mén)多薩假單胞菌[6]中被檢出。目前，尚未見(jiàn)腐生葡萄球菌中關(guān)于耐藥基因的報(bào)道。本研究在羊源腐生葡萄球菌中檢出了TEM、aac(6′)-Ⅰb、aac(3)-Ⅱa和Sul2共4種耐藥基因。由此可見(jiàn)，這些耐藥質(zhì)粒存在于不同種類(lèi)的細(xì)菌之中，耐藥基因在不同物種、不同細(xì)菌之間廣泛轉(zhuǎn)移導(dǎo)致多種細(xì)菌對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥，耐藥性的產(chǎn)生除與地區(qū)或養(yǎng)殖場(chǎng)藥物使用頻繁程度有關(guān)外，還與耐藥基因的轉(zhuǎn)移、變異有著密切的聯(lián)系。

近年來(lái)，關(guān)于腐生葡萄球菌的藥敏試驗(yàn)報(bào)道尚少。有研究檢測(cè)到36株人源腐生葡萄球菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)藥物(慶大霉素、妥布霉素等)敏感率為100%[14]，對(duì)苯唑西林、青霉素耐藥，對(duì)頭孢噻吩敏感[15]，對(duì)慶大霉素、鏈霉素耐藥[4]。本研究藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，羊源腐生葡萄球菌菌株S.S QJ-01對(duì)環(huán)丙沙星、慶大霉素、妥布霉素等抗生素敏感，這一結(jié)果與文獻(xiàn)[4]結(jié)果不一致，可能是菌株分離源不同或者與該羊場(chǎng)對(duì)此類(lèi)抗生素使用較少有關(guān)。

本研究對(duì)從羊源分離到的菌株S.S QJ-01進(jìn)行了常規(guī)鑒定及生物學(xué)特性分析，確定該菌為腐生葡萄球菌。該菌對(duì)小鼠具有較強(qiáng)致病性，對(duì)頭孢唑林、環(huán)丙沙星、復(fù)方新諾明等敏感，對(duì)青霉素、克林霉素、多黏菌素E等耐藥。臨床中可根據(jù)藥敏試驗(yàn)，優(yōu)先使用慶大霉素、妥布霉素、頭孢噻吩等藥物治療由腐生葡萄球菌引起的感染。