牧草青貯乳酸菌研究進展

張志飛，王青蘭

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，湖南 長沙 410128）

新鮮的或萎蔫的或者是半干的青綠飼料（牧草、飼料作物、多汁飼料及其他新鮮飼料），在密閉條件下利用青貯原料表面上附著的乳酸菌發(fā)酵作用，或者在外來添加劑的作用下促進或抑制微生物發(fā)酵，使青貯原料pH 值下降而保存的飼料叫青貯飼料，這一過程稱為青貯。青貯過程中發(fā)揮重要作用的微生物是乳酸菌 （Lactic acid bacteria，LAB）［1］。乳酸菌是能利用可發(fā)酵性碳水化合物中產(chǎn)生乳酸的細菌總稱。目前已知的乳酸菌多數(shù)屬于厚壁菌門細菌，分布在4 綱7 目18 科的39 屬；另外還有少量放線菌門細菌屬于乳酸菌［2］。

1 乳酸菌發(fā)酵類型

乳酸發(fā)酵（Lactic Acid Fermentation）是指某些微生物利用葡萄糖經(jīng)無氧發(fā)酵而生成乳酸的過程。根據(jù)代謝途徑不同，乳酸菌可分為專性同型發(fā)酵（Obligately homofermentative）、 專 性 異 型 發(fā) 酵（Obligately heterofermentative） 及兼 性 異 型 發(fā) 酵（Facultatively heterofermentative） 三種類型［3-4］。

專性同型乳酸菌在厭氧環(huán)境下利用葡萄糖為底物通過糖酵解途徑（Embden-Meyerhof-Parnas pathway，EMP 途徑）產(chǎn)生中間產(chǎn)物丙酮酸，進一步產(chǎn)生乳酸。理論上可以將1 mol 葡萄糖轉(zhuǎn)化生成2 mol 乳酸。同型發(fā)酵乳酸菌主要包括乳桿菌屬（Lactobacillus）的嗜酸乳桿菌（L. acidophilus）、唾液乳桿菌（L.salivarius）、德氏乳桿菌（L. delbrueckii）、瑞士乳桿菌（L.helveticus）、瘤胃乳酸桿菌（L.ruminis）、片球菌屬（Pediococcus）的有害片球菌（P. damnosus）等。

專性異型乳酸菌在厭氧環(huán)境下以葡萄糖為底物通過戊糖磷酸途徑（Hexose Monophosphate Pathway，HMP途徑）經(jīng)過5步酶催化作用產(chǎn)生5-磷酸-木酮糖，然后進入磷酸酮解酶途徑（Phosphoketolase Pathway），在磷酸酮解酶的催化作用下分解為乙酰磷酸和3-磷酸-甘油醛；乙酰磷酸最終轉(zhuǎn)化為乙醇；而3-磷酸-甘油醛經(jīng)EMP 途徑生成丙酮酸，進一步產(chǎn)生乳酸。專性異型發(fā)酵乳酸菌主要有乳桿菌屬（Lactobacillus）的布氏乳桿菌（L. buchneri）、短乳桿菌（L.brevis）、發(fā)酵乳桿菌（L. fermenum）、羅伊氏乳菌（L.reuteri）、明串珠菌屬（Leuconostoc）和魏斯氏球菌屬（Weissella）的細菌。

兼性異型發(fā)酵乳酸菌兼具進行同型乳酸發(fā)酵和異型乳酸發(fā)酵途徑，發(fā)酵產(chǎn)物與發(fā)酵原料、發(fā)酵環(huán)境密切相關(guān)。主要兼性異型發(fā)酵乳酸菌包括：乳桿菌屬（Lactobacillus）的植物乳桿菌（L.plantarum）、干酪乳桿菌（L.casei）、彎曲乳桿菌（L.curvatus）、草乳桿菌（L. graminis）、沙克乳桿菌（L.sakei）、戊糖乳桿菌（L. pentosus）、鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus），片球菌屬（Pediococcus）的乳酸片球菌（P.acidilactici）、戊糖片球菌（P. pentosaceus）和屎腸球菌（Enterococcus faecium） 等［5-6］。

2 表面附生乳酸菌種群分布

附生微生物（Epibiotic mincroorganism）是指生活在植物上的附生微生物。植物附生微生物種群是動態(tài)變化的，受氣候特征、溫度、植物種類、植物生育期等外界環(huán)境的影響。附生微生物中除了乳酸菌這類益生菌外，還包括厭氧的梭狀芽孢桿菌屬（Clostridium），兼性厭氧的泛菌屬（Pantoea）［7］，需氧的芽孢桿菌屬（Bacillus），藍細菌（cyanobacteria）和大腸菌群（coliform bacilli）［7-9］。好氧性細菌和大腸桿菌的數(shù)量多，而有益的乳酸菌含量較低。

張志霞等［10］發(fā)現(xiàn)青藏高原小麥（Triticum aestivum）莖葉和根際土壤中主要是大腸桿菌（105～109CFU/g）和好氧性細菌（106～109CFU/g）；乳酸菌含量較低（102～108CFU/g），這些乳酸菌主要來自于乳桿菌屬（Lactobacillus）的植物乳球菌（L. plantarum）；乳球菌屬（Latococcus）的格氏乳球菌（L. garvieae）；鏈球菌屬 （Streptococcus） 的假肺炎鏈球菌 （S. pseudopneumoniae）、明串珠菌屬（Leuconostoc）的腸膜明串珠菌（L. mesenteroidessubsp.mesenteroides）、霍氏明串珠菌（L.holzapfelii）和乳酸明串珠菌（L.lactis）、片球菌屬（Pediococcus）的戊糖片球菌（P.pentosaceus）以及腸球菌屬（Enterococcus）的雞腸球菌（E. gallinarum）和蒙氏腸球菌（E. mundtii），其中球菌占絕大多數(shù)。

Müller 等［9］發(fā)現(xiàn)德國東北部低地的廣闊草原地區(qū)草地植物表面附生乳酸菌主要包括：乳酸桿菌屬（Lactobacillus） 的L. plantarum，L. brevis，L. casei，L.rhamnosus，L. curvatus，L. gasseri和L. pentosus，總量不超過1×103CFU/g；片球菌屬（Pediococcus）的戊糖片球菌（P.pentosaceus），乳酸菌片球菌（P.acidilactici），P.damnosus，總量也不超過1×103CFU/g；附生乳酸菌中還有少量的腸球菌屬（Enterococcus）的糞腸球菌（E. faecalis），蒙氏腸球菌（E. mundtii），鉛黃腸球菌（E. casseliflavus），屎腸球菌（E. faecium）和硫磺腸球菌（E.sulfureus），腸球菌間具有一定的拮抗作用［11］；這些菌株均對萬古霉素（vancomycin）敏感，但幾乎所有菌株對慶大霉素（gentamycin） 和鏈霉素（streptomycin） 均耐藥［9］。

Yang 等［7］在南方地區(qū)新鮮紫花苜蓿中分離到附生乳酸菌主要包括乳桿菌（Lactobacillus），乳球菌（Lactococcus）和魏斯氏菌（Weissella）。郭琳娜等［12］在上海地區(qū)35 個紫花苜蓿（Medicago sativa）品種中篩選出低可溶糖環(huán)境下，能于24 h 內(nèi)將培養(yǎng)基pH 值降至4.0 以下的產(chǎn)酸能力強的戊糖片球菌（Pediocoecu spenlosaceus），該菌對李斯特菌屬（Listeria）的抑菌率達77.61%，而對大腸桿菌（Escherichia coli）和沙門氏菌屬（Salmonella）的抑菌率分別為65.67%和13.70%。

中國北方牧場青貯玉米表面附生乳酸菌含量低，以乳酸乳球菌（Lactococcus lactissubsp.Cremoris）、韓國魏斯氏球菌（Weissella koreensis） 和布氏乳桿菌（Lactobacillus buchneri）等為主［13］。中國南方地區(qū)優(yōu)質(zhì)玉米青貯 （pH 值＜4.2 和 36.26～79.83 mg/g DM 乳酸含量） 的飼料原料表面附生細菌主要以魏氏菌（Weissella） 為主［14］。

綜合來看，目前已知植物附生乳酸菌包括：乳酸桿菌（Lactobacillus）、明串珠球菌（Leuconostoc）、乳酸球菌（Lactococcus）、鏈球菌（Streptococcus）、腸球菌屬（Enterococcus）、片球菌（Pediococcus）和魏斯氏球菌（Weissella），其中片球菌（Pediococcus）和明串珠球菌（Leuconostoc）是其中優(yōu)勢的產(chǎn)乳酸球菌。南方地區(qū)植物附生乳酸菌中魏斯氏球菌（Weissella）含量較豐富。所有附生乳酸菌中同型發(fā)酵乳酸菌量較低。植物原料附生乳酸菌種類、數(shù)量及其生理生化特性是影響青貯發(fā)酵的重要因素。如果消除外源微生物，添加外源乳酸菌可以獲得更優(yōu)質(zhì)的青貯發(fā)酵品質(zhì)［7］；但這似乎在生產(chǎn)中不可能實現(xiàn)。因此，研究植物附生乳酸菌菌群及其特性可明確青貯生產(chǎn)中適宜類型乳酸菌的選擇。

表1 植物附生乳酸菌和青貯飼料中乳酸菌明細Table 1 Lists of epiphytic Lactobacillus and Lactobacillus in silage

續(xù)表

3 青貯飼料乳酸菌種群分布

青貯飼料中乳酸菌種類較豐富，不同地區(qū)、不同青貯原料的青貯飼料中乳酸菌種群結(jié)構(gòu)和數(shù)量差異較大。保安安等［15］對青藏高原垂穗披堿草（Elymus nutans）青貯飼料中乳酸菌多樣性研究的結(jié)果表明，垂穗披堿草青貯飼料中共分離得到108個乳酸菌菌株，分屬于6 個屬，18 個種。其中乳桿菌屬50 株，明串珠菌屬39 株，魏斯氏菌屬7 株，腸球菌屬6 株，片球菌屬 3 株和乳球菌屬 3 株。Pang 等［16］研究發(fā)現(xiàn)玉米青貯后主要乳酸菌包括食竇魏斯氏菌（Weissellacibaria）（8.5%），戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）（16.9%），假腸膜明串珠菌（Leuconostoc pseudomesenteroides）（8.5%），植物乳桿菌（L. plantarum subsp.plantarum）（57.6%） 和蒙氏腸球菌 （E. mundtii）（8.5%）。Xu等［17］發(fā)現(xiàn)全株玉米青貯飼料中98%的乳酸菌是乳桿菌（Lactobacillus），包括耐酸乳桿菌（L. acetotolerans）、青貯飼料乳桿菌（L. silagei）、類谷糠乳桿菌（L.parafarraginis）、布氏乳桿菌（L.buchneri） 和臭豆腐乳桿菌 （L.odoratitofui）。Pang等［18］還發(fā)現(xiàn)高梁和飼用水稻青貯中主要乳酸菌是植物乳桿菌（L. plantarum）；苜蓿青貯中主要是假腸膜明串珠菌（L. pseudomesenteroides），植物乳桿菌（L. plantarum）和類植物乳桿菌（L.paraplantarum）；不過苜蓿青貯的品質(zhì)較差。馬召穩(wěn)等［19］報道苜蓿青貯飼料中乳酸菌主要有：乳桿菌屬的植物乳桿菌及短乳桿菌（L. brevis）；乳球菌屬 （Lactococcus） 的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）；片球菌屬（Pediococcus）的乳酸片球菌（P. acidilactici）和腸球菌屬（Enterococcus）的糞腸球菌（E. faecalis）和屎腸球菌（E. faecium）。

西南高溫高濕地帶玉米和雜交象草青貯料中的乳酸菌以乳酸桿菌屬、片球菌屬（Pediococcus）和魏斯氏菌屬（Weissella）為主，其中植物乳桿菌（L.plantarum）、鼠李糖乳桿菌（L. rhamnosus）和副干酪乳桿菌（L. paracasei）是優(yōu)勢菌株；戊糖片球菌（P.pentosaceus）、乳酸菌片球菌（P.acidilactici）、谷糠乳桿菌（L.farraginis）、唾液乳桿菌（L.salivarius）、食竇魏斯氏菌（Weissella cibaria） 和類腸膜魏斯氏菌（W.paramesenteroides） 也有分布［20］。

目前在青貯飼料中發(fā)現(xiàn)的乳酸菌主要分布在厚壁菌門芽胞桿菌綱芽胞桿菌目，主要包括7 個屬：乳桿菌屬（Lactobacillus）、片球菌屬（Pediococcus）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、腸球菌屬（Enterococcus）、乳球菌屬（Lactococcus）、鏈球菌屬（Streptococcus）和魏斯特氏菌屬（Weissella）。其中乳酸桿屬、明串珠菌屬、片球菌屬和鏈球菌屬是核心乳酸菌成員。

4 乳酸菌對青貯飼料品質(zhì)的影響

青貯調(diào)制過程中添加適宜的乳酸菌制劑對提高青貯發(fā)酵品質(zhì)、營養(yǎng)品質(zhì)以及有氧穩(wěn)定性等至關(guān)重要，生產(chǎn)實踐中乳酸菌接種劑的添加效果受菌種類型、接種量、青貯原料中水溶性碳水化合物含量等多種因素的影響。外源添加適宜的同型乳酸菌可以產(chǎn)生較多的乳酸，降低環(huán)境pH 值，達到縮短發(fā)酵時間，抑制不良微生物活動，從而提高青貯發(fā)酵品質(zhì)；外源添加異型乳酸菌可以產(chǎn)生乳酸和揮發(fā)性脂肪酸，抑制好氧細菌的生長，提高青貯飼料的有氧穩(wěn)定性；另外還有一些具有纖維素酶活性的乳酸菌具有提高青貯飼料纖維品質(zhì)作用。目前大多數(shù)商品接種劑以兼性異型發(fā)酵乳酸菌為主，包括兼性異型發(fā)酵乳酸菌：植物乳桿菌（L. plantarum）、屎腸球菌（E. faecium）、乳酸片球菌（P. acidilactic）和戊糖片球菌（P.pentosaceus）；專性同型乳酸菌嗜酸乳桿菌（L. acidophilus） 和專性異型乳酸菌布氏乳桿菌（L.buchneri）［6］。

4.1 乳酸菌對青貯發(fā)酵品質(zhì)和營養(yǎng)品質(zhì)的影響

乳酸菌對青貯發(fā)酵品質(zhì)的改善作用主要表現(xiàn)在產(chǎn)生乳酸，提高乳酸發(fā)酵速度。王洋［21］發(fā)現(xiàn)添加不同乳酸菌在一定程度上可提高苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)。也有研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌和其他添加劑混合添加的青貯發(fā)酵效果更好。Hashemzadeh-Cigari［22］和趙慶杰［23］均發(fā)現(xiàn)，與單獨添加乳酸菌制劑組相比，乳酸菌制劑+糖蜜組顯著提高了青貯發(fā)酵品質(zhì)。Ke 等［24］研究發(fā)現(xiàn)混合添加果酸和植物乳酸菌或者檸檬酸和植物乳桿菌均可以有效降低苜蓿青貯中非蛋白氮的產(chǎn)生，而且果酸添加還有助于抑制青貯苜蓿中的脂肪酸的生物氫化（biohydrogenation，BH）。

4.2 乳酸菌對青貯有氧穩(wěn)定性的影響

青貯過程中或青貯飼料飼喂過程中，一旦氧氣進入，酵母菌作為青貯飼料有氧腐敗的啟動者，利用糖類和發(fā)酵產(chǎn)生的酸類進行快速生長繁殖，導(dǎo)致pH 值升高，隨后其他好氧雜菌（霉菌、梭菌等）生長，發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，同時乳酸含量下降，pH 值進一步上升，產(chǎn)生二氧化碳、水和氨，導(dǎo)致青貯飼料的質(zhì)量和消化性能降低［25］。青貯中接種異型發(fā)酵乳酸菌或兼性異型乳酸菌可產(chǎn)生乙酸或者1，2-丙二醇，1，2-丙二醇進一步代謝為丙醇和丙酸，乙酸和丙酸通過抑制腐敗菌，改善青貯好氧穩(wěn)定性，如布氏乳桿菌（L. buchneri）、希氏乳桿菌（L.hilgardii）和類谷糠乳桿菌（L.parafarraginis）、短乳桿菌（L. brevis）和屎腸球菌（E.faecium）等，在青貯發(fā)酵中發(fā)揮著增加有氧穩(wěn)定性的作用［26-32］。Zielińska 等［30］發(fā)現(xiàn)兼性異型乳酸菌Lactobacillus buchneriAKKP 2047p能夠?qū)?，2-丙二醇代謝成丙酸，并且葡萄糖和鈷胺素對其代謝有促進作用。不同發(fā)酵類型的乳酸菌符合使用對有氧穩(wěn)定性亦有積極作用，如塔娜等［33］發(fā)現(xiàn)布氏乳桿菌單獨或與蒙氏腸球菌和植物乳桿菌聯(lián)合接種均可有效抑制無芒雀麥青貯的有氧腐敗，保證無芒雀麥青貯有氧暴露期間品質(zhì)的穩(wěn)定，且前者更有效。

乳酸菌和纖維素酶或其他物質(zhì)混合后添加或可影響青貯飼料的有氧穩(wěn)定性。籽粒莧（Amaranthus hypochondriaus）和水稻秸稈混合青貯中同時添加乳酸菌和纖維素酶的處理和不添加的空白對照相較單獨添加乳酸菌或纖維素酶的處理組更易于發(fā)生有氧腐敗［34］。

5 研究展望

以乳酸菌發(fā)酵為主的青貯飼料除了為家畜提供優(yōu)質(zhì)的能量、蛋白等營養(yǎng)外，還可在青貯過程中產(chǎn)生少量或者微量的功能性代謝產(chǎn)物，如乳酸、乙酸、甲酸、鄰苯二酚、3-苯乳酸、4-羥基苯甲酸、壬二酸、3,4-二羥基苯甲酸、4-羥基肉桂酸、鄰苯二酚、鄰苯三酚和阿魏酸等具有抗菌活性或抗氧化作用；乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharide，EPS），乳酸菌素（lactocidon）、嗜酸乳菌素（acidolin）、嗜酸桿菌素（acidophilin）、乳酸鏈球菌素 （nisin） 等細菌素（Bacteriocin）；非蛋白質(zhì)功能性氨基酸γ-氨基丁酸（γaminobutanoic acid，GABA）等。這些物質(zhì)除了可以提高青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性外，還發(fā)揮著抑制不耐酸的有害微生物生長和繁殖、降解飼料中真菌毒素，調(diào)節(jié)家畜非特異性免疫力、改善腸道功能等益生作用［17，35-37］。

隨著我國畜牧業(yè)健康發(fā)展的不斷推進，特別是近年來抗生素逐漸退出養(yǎng)殖業(yè)，青貯飼料因其營養(yǎng)作用和特殊的生理功能，已經(jīng)逐漸從草食家畜養(yǎng)殖向單胃家畜養(yǎng)豬滲透［38］。近年來各類測序技術(shù)和組學(xué)技術(shù)的不斷豐富完善，對青貯原料、青貯過程中乳酸菌及其他微生物種群動態(tài)變化研究及新菌株的開發(fā)提供了便利。青貯研究今后應(yīng)繼續(xù)加強不同青貯原料以及混合青貯的發(fā)酵機理、微生物動態(tài)變化，以及在動物生產(chǎn)性能、動物疾病等方面的調(diào)控作用等方面的研究，為青貯飼料產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定科學(xué)基礎(chǔ)。