dCTP焦磷酸酶在乳腺癌組織中的表達情況及臨床意義研究

王銘，李坤，李春景

（濮陽市第五人民醫(yī)院，河南 濮陽 457000）

乳腺癌作為威脅女性健康的常見疾病正受到醫(yī)學界的密切關(guān)注。研究顯示[1-2]，不同地區(qū)患者預后差異較大，這可能與醫(yī)療基礎(chǔ)設(shè)施水平等因素有關(guān)，對于發(fā)達國家而言，通過早期篩查、及時醫(yī)治能大大降低乳腺癌的病死率，患者的5年生存率也較高。當下，我國對于乳腺癌的早期鑒別診斷及醫(yī)療措施手段方面均有所欠缺,探尋行之有效的乳腺癌診療標志物是目前臨床丞待解決的關(guān)鍵問題。文獻報道[3-5]，dCTP焦磷酸酶（dCTPPyrophosphatase 1，DCTPP1）在前列腺癌、胃癌等癌組織中呈現(xiàn)過表達狀態(tài)，并有證據(jù)顯示其過表達狀態(tài)可能與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理因素存在一定關(guān)系，更高的DCTPP1表達水平可能預示著患者有更高的疾病復發(fā)率及更短的生存時間。盡管已有少數(shù)國外學者報道DCTPPl在乳腺癌組織中的表達水平及與臨床特征的關(guān)系，但國內(nèi)針對該部分領(lǐng)域的研究仍處于起步階段?；诖?，本研究創(chuàng)新性地嘗試對比DCTPPl在乳腺癌組織及癌旁組織中的表達情況，并探討癌組織中DCTPPl表達水平與各類臨床病理特點及患者預后的關(guān)系，初步探究DCTPPl在表達在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的潛在意義，為今后臨床探尋新的乳腺癌診療靶點提供資料依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年6月至2017年12月在本院行手術(shù)治療乳腺癌的女性患者82例，每例標本均取癌組織為癌組織組，取距癌邊緣5 cm以上的正常組織為癌旁組織組。其中，年齡38～68歲，平均（53.19±7.32）歲；腫瘤分級：Ⅰ級5例，Ⅱ級46例，Ⅲ級31例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移30例；非浸潤性癌8例，浸潤性癌74例。經(jīng)患者及家屬的知情同意并簽署知情同意書，本研究經(jīng)本院道德倫理委員會批準。

1.2 納入與排除標準 納入標準：⑴均經(jīng)病理檢查證實為乳腺癌；⑵蠟塊保存完好，病例及隨訪資料完整；⑶手術(shù)前無免疫治療或放、化療史。

排除標準：⑴伴其他原發(fā)性腫瘤；⑵所需資料缺失；⑶伴重要臟器嚴重功能障礙；⑷伴精神疾病。

1.3 方法

1.3.1 資料收集 收集患者的臨床資料，包括年齡、腫瘤分級、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、組織類型、雌激素受體（Estrogen Receptor，ER）、孕激素受體（Progesterone Receptor，PR）、人類表皮生長因子受體2 （human epidermalgrowth factor receptor-2，HER-2）表達情況。通過電話、門診復查等方式，隨訪患者自治療后3年內(nèi)疾病復發(fā)或死亡情況。

1.3.2 組織標本處理 使用氯化鈉溶液將標本進行沖洗后以10%的中性福爾馬林固定，酒精梯度脫水，常規(guī)石蠟包埋，使用RM2335型切片機（德國萊卡公司）對石蠟標本進行切片，厚度4μm。

1.3.3 免疫組化染色檢測DCTPPl表達水平 將石蠟切片放入恒溫箱中進行烘烤（溫度65℃，時間30 min），隨后依次使用梯度濃度的二甲苯和酒精來進行脫蠟、水化。室溫下使用自來水、蒸餾水依次沖洗各2 min后將切片放入3%H2O2的PBS溶液中，浸泡約10 min，PBS反復沖洗3次后使用抗原修復液進行修復。修復結(jié)束后再次使用PBS反復漂洗、浸泡3次，加入山羊血清，室溫封閉10 min。將切片表面多余的山羊血清甩去，向其滴加50～100μl的DCTPPl抗體（濃度1：300，購自英國Abcam公司），4℃孵育過夜（注：陰性對照中用PBS替代一抗）。PBS反復沖洗3次，向其滴加Streptavidin-HRP工作液（濃度1：200，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司），再次放入恒溫箱中進行孵育（溫度37℃，時間60 min）。PBS反復沖洗3次后，向其滴加DAB（購自美國Sigma-Aldrich公司）顯色3～5 min，蘇木素復染2～3 min，再以0.1%鹽酸進行分化后應(yīng)用自來水沖洗，二甲苯透明，最后中性樹脂封片。

評分標準：由2位5年以上相關(guān)經(jīng)驗的資病理科醫(yī)師對切片結(jié)果來進行雙盲評分，在光學顯微鏡下隨機選取5個視野（400倍），陽性染色細胞定義為細胞核或（和）細胞質(zhì)顯示為棕黃色。采用來DCTPP1陽性細胞比例對染色強度進行評分：+（＜25%），++（25%～49%），+++（50%～74%），++++（≥75%）。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 22.0軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以%表示，采用χ2檢驗；計量資料以±s表示，2組間比較采用兩樣本獨立t檢驗，3組間比較采用單因素方差分析；采用Spearman相關(guān)性分析乳腺癌患者DCTPP1表達水平與臨床病理因素及預后的相關(guān)性；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 2組DCTPP1表達水平比較 癌組織細胞核DCTPP1評分較癌旁組織明顯升高（P＜0.05），但二者細胞質(zhì)DCTPP1評分比較差異不明顯（P＞0.05）。見表1。

表1 2組DCTPP1表達水平比較（±s）

表1 2組DCTPP1表達水平比較（±s）

注：與細胞核相比，a P＜0.05。

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2.2 核DCTPP1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系不同年齡、組織類型及ER、PR、HER-2表達情況的乳腺癌患者，其核DCTPP1表達水平差異不明顯（P＞0.05），但不同腫瘤分級、T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的乳腺癌患者，其核DCTPP1表達水平差異顯著（P＜0.05）。見表2。

表2 核DCTPP1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

表2 核DCTPP1表達水平與臨床病理特征的關(guān)系（±s）

注：與腫瘤分級中Ⅰ級比，a P＜0.05；與T分期中T1期比，b P＜0.05。

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2.3不同預后患者癌組織DCTPP1表達水平比較預后不良組細胞核DCTPP1評分較預后良好組明顯升高（P＜0.05），但二者DCTPP1細胞質(zhì)DCTPP1評分率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 不同預后患者癌組織DCTPP1表達水平比較（±s）

表3 不同預后患者癌組織DCTPP1表達水平比較（±s）

注：注：與細胞核相比，a P＜0.05；b預后不良定義為3年內(nèi)疾病復發(fā)或患者死亡。

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2.4 核DCTPP1表達水平與臨床病理因素及預后的相關(guān)性 采用Spearman相關(guān)性分析乳腺癌患者DCTPP1表達水平與臨床病理因素及預后的相關(guān)性（變量賦值：腫瘤分級，Ⅰ期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期=3；T分期，T1=1，T2=2，T3=3；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：無轉(zhuǎn)移=0，有轉(zhuǎn)移=1；預后，預后良好=0，預后不良=1），結(jié)果顯示，乳腺癌患者核DCTPP1表達水平與腫瘤分級、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。見表4。

表4 癌組織核DCTPP1表達水平與臨床病理因素及預后的相關(guān)性

3 討論

核苷三磷酸焦磷酸酶(nucleotide triphosphates pyrophosphatase，NTP-PPase)是一種能水解核苷三磷酸（nucleotide triphosphates，NTPs）的酶，水解產(chǎn)物包括焦磷酸和核苷單磷酸，其能夠?qū)⒛[瘤細胞中的非正常核苷酸進行水解，從而維持機體核苷酸池內(nèi)常見NTPs的平衡狀態(tài)，并及時清掃具有細胞毒性的代謝產(chǎn)物，以此來減少非正常核苷酸的摻入水平，降低突變風險，從而發(fā)揮保障DNA準確復制的效用，承擔“守門員”的作用[6]。DCTPP1屬于NTP-PPase蛋白超家族一員，表達于人類細胞，被發(fā)現(xiàn)與多種腫瘤組織學亞型、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況等有一定相關(guān)性[7-9]。

目前國內(nèi)針對DCTPP1在乳腺癌組織中的表達研究較少，僅有少數(shù)學者對比了乳腺癌癌組織與癌旁組織中DCTPP1陽性表達率的區(qū)別，而并未深入探討DCTPP1在腫瘤細胞核和細胞質(zhì)中的表達差異[10]。本組收集了82例乳腺癌患者的腫瘤組織及癌旁組織，檢測了2種組織中DCTPP1表達情況，結(jié)果顯示，2種組織間細胞核DCTPP1評分差異顯著，在乳腺癌患者標本中在癌旁組織的細胞核DCTPP1評分顯著低于腫瘤區(qū)域；同時，乳腺癌腫瘤細胞的細胞核、細胞質(zhì)均檢測到DCTPP1蛋白表達，癌組織中DCTPP1的細胞核陽性表達率較細胞質(zhì)更高，提示癌細胞中存在DCTPP1的核累積現(xiàn)象。我們推測上述現(xiàn)象出現(xiàn)的原因可能與DCTPP1在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中參與了一定的調(diào)控機制有關(guān)。對于維持人體細胞正常工作而言，準確地進行DNA復制十分重要，而一旦機體遭遇病原體感染、氧化損傷等生理病理過程時，容易出現(xiàn)非正常核苷酸，而后增大DNA損傷及誘變的風險[11-13]。為了保持基因組的完整和穩(wěn)定型，NTP-PPase酶修復系統(tǒng)發(fā)揮了關(guān)鍵的預防機制作用，DCTPP1會參與調(diào)節(jié)代謝非正常核苷酸，在癌組織核DNA中DCTPP1會被不斷動員，從而清除非正常核苷酸，維持細胞核苷酸庫高純度，因而表現(xiàn)出DCTPP1在癌細胞中的細胞核累積，以保證腫瘤細胞有絲分裂期間能夠合成正確的DNA。

本研究進一步探討了核DCTPP1表達情況與乳腺癌病理特征間的關(guān)系，結(jié)果表明，不同年齡、組織類型及ER、PR、HER-2表達情況的乳腺癌患者，其核DCTPP1表達水平差異不明顯，但不同腫瘤分級、T分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的乳腺癌患者，其核DCTPP1表達水平差異顯著，與李輝等[10]的研究結(jié)論類似。Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示，乳腺癌患者癌組織核DCTPP1表達水平與腫瘤分級、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著正相關(guān)關(guān)系，證實了核DCTPP1表達水平與乳腺癌腫瘤各病理特征關(guān)系密切。研究表明[14-16]，炎癥反應(yīng)在腫瘤的啟動、誘發(fā)等多個階段都有關(guān)鍵作用，炎癥細胞因子的大量分泌會使癌前細胞的活性氧濃度增大，可能會造成DNA損傷等，使其發(fā)生表觀遺傳學層面的變化，進而促進腫瘤的生成。我們推測在腫瘤分級更高、T分期更后及發(fā)生了淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者中，其乳腺癌出現(xiàn)部位的DNA損傷程度可能較重，因而核苷酸池中非正常核苷酸的占比較高，此時機體的預防機制發(fā)揮重要作用，為降低突變風險，維持核苷酸池的平衡狀態(tài)，機體會顯著上調(diào)DCTPPl蛋白表達，因而我們觀察到此類患者的癌組織細胞中DCTPPl表達水平出現(xiàn)進一步提升。此外，本研究觀察到預后不良患者的核DCTPPl表達水平顯著高于預后良好患者，且核DCTPPl表達水平與患者預后正相關(guān)關(guān)系，提示通過檢測核DCTPPl表達水平可能對乳腺癌患者預后情況有潛在的預測價值。一般而言，腫瘤分級較低、T分期靠前及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的乳腺癌腫瘤患者接受治療后預后較好，DCTPPl表達水平較高的患者其腫瘤進展的程度往往較高、病灶較大，因此患者預后情況出現(xiàn)相對不理想的概率更大。

綜上所述，DCTPPl在乳腺癌組織腫瘤細胞核中表達水平明顯上升，其與腫瘤分級、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后存在正相關(guān)關(guān)系，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中可能扮演關(guān)鍵角色，對乳腺癌患者預后有潛在的預測價值。