非酒精性肝病患者血清中G-CSF、sTREM1、TNF-α水平和腸道菌群分布變化的關(guān)聯(lián)性分析

鄒輝鑫

（南陽市中心醫(yī)院檢驗科，河南 南陽 473000）

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是一種與脂代謝、胰島素抵抗（Insulin resistance,IR）等相關(guān)的臨床綜合征[1]，主要病理特征為彌漫性肝細(xì)胞脂肪沉積和肝實質(zhì)細(xì)胞變性，但NAFLD的發(fā)病機(jī)制目前仍未完全明確，同時其發(fā)病率近年來不斷攀升，成為威脅人類健康的重要問題[2]。有報道指出[3]，NAFLD與代謝綜合征有緊密聯(lián)系；近年來的研究認(rèn)為不同糖代謝的NAFLD患者腸道菌群變化較為顯著[4]；腫瘤壞死因子-α（Tumour necrosis factor-α,TNF-α）能促進(jìn)炎性因子釋放加重肝細(xì)胞損傷；粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（Granulocyte macrophage colony factor,GM-CSF）是一種造血因子，其在血管內(nèi)皮細(xì)胞受損時大量釋放，進(jìn)而調(diào)控機(jī)體免疫；可溶性髓樣細(xì)胞觸發(fā)受體（Soluble triggering receptors expressedon myeloid cells,sTREM-1）則是近些年發(fā)現(xiàn)的感染預(yù)測因子，預(yù)測敗血癥等方面效果頗佳[5]。目前NAFLD的血清學(xué)指標(biāo)與腸道菌群均有相關(guān)研究[6-7]，但涉及上述指標(biāo)的較為少見，基于此，本研究分析NAFLD患者血清GM-CSF、和sTREM-1、TNF-α水平和腸道菌群變化關(guān)聯(lián)性，為探明NAFLD的發(fā)病機(jī)制提供較好的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2019年6月至2021年7月于本院收治的72例NAFLD患者為病例組，并根據(jù)不同預(yù)后情況將病例組分為預(yù)后不佳組和預(yù)后良好組，另外征集同期于本院體檢健康者30例作為對照組，病例組男45例、女27例，平均年齡（48.57±10.38）歲，體質(zhì)指數(shù)（24.02±3.45）kg/m2；對照組男19例、女11例，平均年齡（49.12±9.79）歲，體質(zhì)指數(shù)（23.34±2.76）kg/m2。兩組組間一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，本研究已獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合臨床對NAFLD的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，經(jīng)影像學(xué)檢測，肝臟近場回聲增強(qiáng)，遠(yuǎn)場回聲減弱，且肝臟管道結(jié)構(gòu)顯示模糊；⑵患者對研究了解知情。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴酒精性脂肪性肝??；⑵合并心、肺、腎等臟器患嚴(yán)重疾?。虎墙诜媚c動力藥、微生物制劑；⑷因病毒性肝炎、腎功能不全、血液疾病等導(dǎo)致脂肪肝；⑸妊娠、孕期婦女；⑹既往有胃腸道病史。

1.2 方法 ⑴血清標(biāo)本檢測：入組后清晨采集所有受試者的靜脈血標(biāo)本，靜置1 h，使用低速離心機(jī)（中科中佳,SC-3616）于室溫中1500 r/min離心20min，取上清裝于EP管，送至低溫冰箱封存，融凍一天后樣本未出現(xiàn)溶血、絮狀現(xiàn)象，外觀無異常，進(jìn)行下一步檢測。采用酶聯(lián)免疫法檢測血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平，試劑盒購自北京中杉金橋生物公司，檢測步驟按照說明書進(jìn)行操作。同時使用全自動生化分析儀測定空腹血糖（Fasting blood glucose,FPG），空腹胰島素（Fasting insulin,FINS），另外用胰島素抵抗指數(shù)（Homeostasis model assessment,HOMA-IR）表示胰島素敏感性和IR程度，根據(jù)計算公式HOMA-IR=FPG×FINS/22.5；⑵腸道菌群檢測：入組后采集所有受試者的糞便0.5 g，制成標(biāo)本送檢，用連續(xù)稀釋法稀釋成10～1至10～7后，依照各菌種的正常菌數(shù)范圍進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，厭氧型置入?yún)捬鹾袃?nèi)在恒溫箱培育72 h，需氧型置入有氧環(huán)境中，在恒溫箱培育24 h，統(tǒng)計培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，檢測雙歧桿菌、酵母菌、腸桿菌、腸球菌的菌群數(shù)量，轉(zhuǎn)化成對數(shù)值（LgCFU/g），來定量表示腸道菌群的水平，并計算雙歧桿菌/腸桿菌比值（B/E）；⑶腸道菌群Alpha多樣性指數(shù)：所有受試者入組后行腸鏡檢測，在距肛門20 cm處提取1塊黏膜組織進(jìn)行檢測，使用細(xì)菌基因組DNA試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物科技公司），應(yīng)用Novaseq PE250（美國Illumina公司）進(jìn)行上機(jī)質(zhì)檢、測序，根據(jù)說明書操作步驟，提取黏膜組織DNA，使用Uparse軟件對測序得到的有效序列進(jìn)行分類[9]，得到分類單元（Operational taxonomic units,OTU），使用Alpha分析對腸道菌群多樣性進(jìn)行觀察，包括Chao1、Shannon、Simpson指數(shù)，Chao1指數(shù)估計樣本所含OTU的總數(shù)，Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)估計微生物樣本群落的多樣性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用IBM SPSSStatistics 24.0軟件行統(tǒng)計學(xué)分析，對正態(tài)分布的計量資料以（±s）表示，采用獨(dú)立t檢驗；計數(shù)資料使用率（%）表示，行χ2檢驗，采用Spearman法分析腸道菌群水平與血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平的相關(guān)性，采用ROC曲線分析血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α對NAFLD預(yù)后的評估效能，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組腸道菌群變化比較 結(jié)果顯示，病例組的雙歧桿菌、酵母菌數(shù)目和B/E值顯著低于對照組，腸桿菌、腸球菌數(shù)目顯著高于對照組（P＜0.05），見表1。

表1 兩組腸道菌群變化比較（LgCFU/g,±s）

表1 兩組腸道菌群變化比較（LgCFU/g,±s）

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2.2 兩組腸道菌群多樣性比較 結(jié)果顯示，兩組的Chao1指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；病例組的Shannon指數(shù)低于對照組，而Simpson指數(shù)高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組腸道菌群多樣性比較（±s）

表2 兩組腸道菌群多樣性比較（±s）

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2.3 兩組血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較 結(jié)果顯示，病例組的GM-CSF、sTREM-1以及TNF-α水平均高于對照組（P＜0.05），見表3。

表3 兩組血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較（±s）

表3 兩組血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較（±s）

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2.4 兩組其他生化指標(biāo)比較 結(jié)果顯示，病例組的FPG、FINS以及HOMA-IR均高于對照組（P＜0.05），見表4。

表4 兩組其他生化指標(biāo)比較（±s）

表4 兩組其他生化指標(biāo)比較（±s）

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2.5 NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平與B/E相關(guān)性分析結(jié)果 采用Spearman法分析腸道菌群水平與血清GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，GM-CSF、sTREM-1、TNFα、HOMA-IR與B/E呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），見表5。

表5 NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平與B/E相關(guān)性分析結(jié)果

2.6 不同預(yù)后情況NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較 結(jié)果顯示，預(yù)后不佳組的GM-CSF、sTREM-1以及TNF-α水平均高于預(yù)后良好組（P＜0.05），見表6。

表6 不同預(yù)后情況NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較（±s）

表6 不同預(yù)后情況NAFLD患者GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平比較（±s）

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2.7 GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平對NAFLD患者預(yù)后的評估價值 結(jié)果顯示，采用ROC曲線分析GM-CSF、sTREM-1、TNF-α對大腸癌圍術(shù)期感染患者預(yù)后的評估價值，GM-CSF、sTREM-1、TNF-α評估NAFLD患者預(yù)后的AUC為0.811（95%CI：0.701～0.894）、0.800(95%CI：0.689～0.885)、0.808（95%CI：0.699～0.892），TNF-α敏感度最好為75.00%，GM-CSF特異度較高為86.36%，見表7、圖1。

表7 GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平對NAFLD患者預(yù)后的評估價值

圖1 GM-CSF、sTREM-1、TNF-α評估NAFLD患者預(yù)后的ROC曲線

3 討論

NAFLD被認(rèn)為是一種與IR、遺傳易感性等關(guān)系緊密的應(yīng)激性肝受損，較早前已成為歐洲國家較常見的肝病原因，近年來發(fā)病率更是顯示上升的趨勢。NAFLD的臨床危險因素也呈現(xiàn)多樣化的特點(diǎn)[10]，如肥胖、高血壓、糖尿病和代謝綜合征等，部分NAFLD患者可能發(fā)展成為肝硬化，然而由于NAFLD臨床癥狀無明顯特點(diǎn),大多數(shù)患者易忽視進(jìn)而造成漏診、誤診。同時由于該病與代謝綜合征等關(guān)聯(lián)緊密，導(dǎo)致患者機(jī)體代謝紊亂，造成全身性危害,許多患者發(fā)展為肝硬化之前可能已病死于心血管疾病[11]。目前臨床診斷NAFLD的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是肝組織病理活檢，可囿于其創(chuàng)傷性，無法全面推廣,而近些年的無創(chuàng)評估NAFLD病情的工具，均無法取代病理活檢來檢測患者肝纖維化程度，尋找評估NAFLD的血清、生化指標(biāo)已成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[12]。本研究基于此背景進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)NAFLD患者腸道菌群變化和血清細(xì)胞因子GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平存在較好相關(guān)性，且三者水平變化與腸道菌群失衡共同作用，可能導(dǎo)致NAFLD的產(chǎn)生，這一發(fā)現(xiàn)在近年來NAFLD的相關(guān)研究中并不多見,可為研究創(chuàng)新之處，現(xiàn)報告如下。

腸道菌群棲息在人體腸道內(nèi)的微生物群落，種類多、數(shù)量大。人體腸道內(nèi)含有大量細(xì)菌，而不同階段和環(huán)境，腸道菌群數(shù)量都有不同的變化，但對于健康機(jī)體而言，腸道菌群始終保持著動態(tài)平衡。本研究結(jié)果顯示，病例組的雙歧桿菌、酵母菌數(shù)目和B/E值顯著低于對照組，腸桿菌、腸球菌數(shù)目顯著高于對照組，提示相比常人，NAFLD患者的腸道菌群明顯失調(diào)。分析原因，可能是NAFLD患者因肝病變和膽汁異常分泌，腸道內(nèi)pH失調(diào)，結(jié)合型膽汁酸抑制腸道外細(xì)菌的作用降低，繼而導(dǎo)致體內(nèi)腸道菌群失衡[13]；另外由于NAFLD與代謝綜合征的密切關(guān)系，可能引發(fā)患者消化道功能異常，胃腸道動力不足、蠕動減少，腸道清除功能降低，導(dǎo)致大量細(xì)菌過度繁殖，也可能造成菌群失衡。另一方面，研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)病例組的Shannon指數(shù)低于對照組，而Simpson指數(shù)高于對照組。Shannon指數(shù)代表菌群多樣性，Simpson指數(shù)代表菌群豐富度，Shannon指數(shù)值越大，表示多樣性越好，Simpson指數(shù)越大，種類越單一，本結(jié)果提示NAFLD患者的腸道菌群多樣性較常人明顯減少。聯(lián)系上述腸道菌群數(shù)目的結(jié)果來看，NAFLD的腸道菌群失衡、多樣性減少可能與NAFLD的發(fā)病有重要關(guān)聯(lián)[14]。

此外，結(jié)果顯示，病例組的GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平和FPG、FINS、HOMA-IR均高于對照組，說明NAFLD患者相比常人，體內(nèi)炎癥反應(yīng)較明顯，并已出現(xiàn)血糖代謝紊亂和IR現(xiàn)象。造成這一現(xiàn)象，推測原因可能是腸道菌群失調(diào)，導(dǎo)致腸道通透性增加，促進(jìn)細(xì)菌移動，激活細(xì)胞免疫反應(yīng)，從而加重炎癥反應(yīng)。另一方面，研究結(jié)果表明GM-CSF、sTREM-1、TNF-α、HOMA-IR與B/E值均呈負(fù)相關(guān)，B/E值代表厭氧菌抑制致病菌定值腸道的能力，可全面地反映腸道菌群變化情況，因而上述結(jié)果提示腸道菌群的失調(diào)可能與GM-CSF、TNF-α的水平高低和HOMA-IR相關(guān)，考慮到GM-CSF和TNF-α的功能，分析可能是肝細(xì)胞受損時促進(jìn)GM-CSF大量釋放，激活免疫反應(yīng)，加重肝臟病變，而TNF-α的上升代表體內(nèi)炎癥反應(yīng)嚴(yán)重，細(xì)胞浸潤較深，破壞腸黏膜屏障，進(jìn)而腸道菌群失衡，同樣導(dǎo)致肝臟病變發(fā)生，形成惡性循環(huán)[15]。至于sTREM-1與腸道菌群失衡的關(guān)系，推測是sTREM-1誘導(dǎo)級聯(lián)式的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腸黏膜受損，引發(fā)菌群失衡，具體作用機(jī)制尚需要更深入地研究予以闡明。

最后，研究發(fā)現(xiàn)，預(yù)后不佳組患者的GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平高于預(yù)后良好組，同時ROC曲線分析顯示GM-CSF、sTREM-1、TNF-α評估NAFLD患者預(yù)后的AUC為0.811、0.800、0.808，提示GM-CSF、sTREM-1、TNF-α具 有 較 好 評 估NAFLD預(yù)后的效能；亦有研究表明[16-17]，NAFLD的預(yù)后存在多種危險因子，其中包括遺傳因素、基礎(chǔ)疾病、手術(shù)等，這些因素皆有可能對血清標(biāo)志物GM-CSF、sTREM-1、TNF-α的評估效能造成一定影響，因此若臨床將該指標(biāo)納入評估指標(biāo)中，仍需聯(lián)系實際因素綜合進(jìn)行考慮。

綜上，NAFLD患者腸道菌群失衡較為明顯，且GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平異常上調(diào)，腸道菌群變化與GM-CSF、sTREM-1、TNF-α水平有重要相關(guān)，可能共同作用導(dǎo)致NAFLD的發(fā)生，另外GM-CSF、sTREM-1、TNF-α能有效評估NAFLD預(yù)后。同時本研究存在一定局限性，研究樣本偏少，并且未對NAFLD病情有效分類以分析不同病情患者的腸道菌群和血清學(xué)指標(biāo)的聯(lián)系，這些有待于之后擴(kuò)大樣本量，行全面性的研究，予以進(jìn)一步探討。