外周血CD34+細胞對骨髓增生異常綜合征分型及預后意義分析

肖德俊，劉志晴，肖作淼，葉萍，劉聰，鐘明星

（1.江西贛州市人民醫(yī)院檢驗科，江西 贛州 341000；2.江西贛州市人民醫(yī)院手術室，江西 贛州 341000；3.江西贛州市人民醫(yī)院血液科，江西 贛州 341000）

骨髓增生異常綜合征(MDS)是一組造血干/祖細胞惡性克隆性疾病，骨髓表現(xiàn)為造血細胞發(fā)育異?；蛟技毎龆?，外周血表現(xiàn)為血細胞減少或原始細胞增多。根據(jù)2012年MDS國際預后積分IPSS-R，MDS的預后與外周血中性粒細胞計數(shù)，血小板計數(shù)，血紅蛋白含量，骨髓原始細胞數(shù)量以及核型有關。有文獻報道，外周血中的CD34+細胞與MDS的預后也具有一定的相關性。本研究搜集了2018-2019年我院按照2016版WHO標準確診的MDS患者資料，對外周血CD34+細胞百分比與絕對值計數(shù)與MDS患者預后及分型的意義的進行了統(tǒng)計學分析。

1 資料與方法

1.1 標本來源 收集贛州市人民醫(yī)院血液科2018年03月至2019年09月根據(jù)2016版WHO的MICM綜合診斷標準確診的骨髓增生異常綜合征患者51例。其中36位男性，15位女性患者。平均年齡為62.6歲（40～72歲），對照組選取同年齡段的健康體檢患者20例。

1.2 儀器與試劑 儀器為BD FACSCanto II流式細胞儀(美國BD公司產(chǎn)品)，分析軟件為BD FACSCantoTMII。鞘液為BD FACSFlowTM。試劑盒為BDTMStem Cell Enumeration(SCE)試劑盒，包括BD Stem Cell試劑(CD45/CD34)：處于含有BSA和0.1%疊氮化鈉的PBS中，試劑盒包含CD45 FITC,clone 2D1和CD34 PE,clone 8G12.7-AAD試劑：一種核酸染料，用于鑒別死細胞10X氯化銨裂解液：該裂解液不含固定劑，用于紅細胞裂解。BD Trucount管：每一個管中包含一粒凍干的熒光微球。

1.3 檢測方法

1.3.1 抽取患者治療前和健康對照者靜脈血2 ml，EDTA管抗凝。取TruCOUNT管2支，管中含有定量的熒光微球，分別標記為(測定管)和對照管)。⑴往管底加入20μl的BD Stem Cell試劑。注意不要碰到微球。⑵往管中加入20μl 7-AAD試劑。⑶使用反向加樣法，往管中加入100μl充分混勻的樣本，輕微渦旋 混勻。室溫避光孵育20 min(20～25°C)。⑷每管中加入2 ml 1X氯化銨裂解液，輕微渦旋混勻。室溫避光孵育10 min(20～25°C)。⑸立即將樣品置于濕冰上上機檢測，分析并報告結(jié)果，計算外周血循環(huán)CD34+細胞占有核細胞的百分比和絕對值。

1.3.2 IPSS-R預后積分系統(tǒng) 細胞遺傳學，骨髓原始細胞百分比，血紅蛋白，血小板，中性粒細胞計數(shù)進行積分，≤1.5分為極低危，＞1.5-3分為低危，＞3-4.5分為中危，＞4.5-6分為高危，＞6分為極高危。

表1 MDS分型:標準

表2 IPSS-R預后積分系統(tǒng)

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)，IPSS-R分組和健康人的比較采用One-Way ANOVA中的Welch法和Brown-Forsythe法檢驗進行統(tǒng)計學分析，組與組之間的多重比較采用Dunnett T3和Dunnett C進行統(tǒng)計學分析。SLD/MLD組和EB-1/EB-2組之間的比較采用獨立樣本的T檢驗。

2 結(jié)果

CD34+細胞在骨髓增生異常綜合征患者和健康人中的表達，見表3。

表3 外周血CD34+細胞在MDS和健康人中的表達情況

2.1 CD34+細胞在2016版WHO分型中的表達CD34+細胞百分比、絕對值在SLD/MLD分型組中的表達均低于EB-1/EB-2分型組，且百分比的差異絕對統(tǒng)計學意義（P＜0.05），絕對值的差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

2.2 CD34+細胞在骨髓增生異常綜合征IPSS-R預后危險度分組和健康人群中的表達 CD34+細胞在健康人群、IPSS-R極低危、低危、中危、高危、極高危組中的表達逐漸增高，且具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），其中極低危與低危組的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），高危組與極高危組的差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。

3 討論

CD34抗原是唾液酸黏蛋白的I型跨膜磷酸糖蛋白，是未成熟的造血前體細胞和造血集落細胞的一個特異性標記抗原，隨著細胞的成熟逐漸減弱或消失。正常生理情況下，外周血中CD34+細胞極為罕見，百分比約為0.006～0.045%，絕對計數(shù)為0.32～3.50個/μl[1]。在一些病理情況下，外周血CD34+細胞的數(shù)量會增多，比如急慢性白細胞，骨髓增生異常綜合征等疾病[2]。有學者研究了低增生的MDS-RCMD患者和AA疾病組、正常對照組中CD34+細胞表達的差異，發(fā)現(xiàn)MDS-RCMD組CD34+細胞的表達要高于AA組和正常組，且有統(tǒng)計學差異[3-4]，并發(fā)現(xiàn)CD34+細胞＞0.5%作為可以作為一個臨界鑒別指標[5]。在本組研究中發(fā)現(xiàn)，CD34+細胞＞0.5%是IPSS-R預后危險度中、高危組與低危組的一個分界指標，同樣在分型中也是SLD/MLD與原始細胞增多組EB-1/EB-2的一個分界指標。骨髓增生異常綜合征患者外周血循環(huán)CD34+細胞百分比及絕對數(shù)不僅高于健康對照者[4]，并且隨著病情的進展持續(xù)升高[6]。有學者認為CD34+細胞可以作為骨髓增生異常綜合征患者IPSS-R中的一個獨立危險因素，且將CD34+細胞百分比＞1%可以作為骨髓增生異常綜合征轉(zhuǎn)化為白血病的一個危險信號[7-9]且與低危型MDS患者的與不良預后有關[10]，其中的機制可能與CD34+細胞自噬活性的減低[11]，Shh信號通路的激活[12]、Gli1基因的表達[13]以及IGF-IR[14]有關。

本研究同時檢測了骨髓增生異常綜合征患者和健康人群外周血CD34+細胞百分比和絕對值，Cesana C等認為CD34絕對值計數(shù)比CD34百分比對骨髓增生異常綜合征預后判斷更為敏感[15]，本研究發(fā)現(xiàn)，CD34絕對值計數(shù)與CD34百分比與骨髓增生異常綜合征的分型和預后相關，且CD34絕對值計數(shù)比CD34百分比在骨髓增生異常綜合征分型中更為敏感，但在IPSS-R預后危險度分組中，二者都是隨著危險度的升高逐漸增加，沒有體現(xiàn)出敏感性的差異，后期可加大樣本量繼續(xù)研究CD34絕對值與百分比對骨髓增生異常綜合征預后的差異性。

2016版WHO中骨髓增生異常綜合征的分型主要依靠形態(tài)學計數(shù)，但形態(tài)學主觀性較強，且手工計數(shù)細胞數(shù)量較少。流式細胞CD34+細胞計數(shù)克服了這一不足，邢江濤等做了316例MDS患者CD34抗原表達和，形態(tài)學計數(shù)的比較，發(fā)現(xiàn)符合率達到了77.21%并且無統(tǒng)計學差異[16]，建議可將CD34+細胞作為骨髓增生異常綜合征WHO分型、IPSS-R危險度分層及預后判斷的一個重要指標。