EV71型HFMD患兒血清25-（OH）D水平與其細(xì)胞免疫功能的相關(guān)性

陳梅，陳芳，宋春蘭

（鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 河南省兒童醫(yī)院 鄭州兒童醫(yī)院 鄭州市兒童急危重癥醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000）

手足口?。℉FMD）是因腸道病毒感染引起的兒科常見(jiàn)急性傳染病，其致病原以腸道病毒71型（EV71）和腸道病毒CA16型較為多見(jiàn)，5歲以下兒童易感[1]。既往研究表明EV71型HFMD在近年來(lái)丙類傳染病中致死率占第一位[2]。一般普通型HFMD預(yù)后良好，而重癥患兒病死率高、預(yù)后差，目前臨床尚未明確該病的致病機(jī)制以及致死原因，因此早期預(yù)測(cè)EV71型HFMD重癥化風(fēng)險(xiǎn)，并及時(shí)給予干預(yù)十分必要。血清25-羥維生素D[25-（OH）D]是反映機(jī)體維生素D（VD）營(yíng)養(yǎng)狀況的最佳指標(biāo)，既往常用于評(píng)估兒童骨骼生長(zhǎng)發(fā)育情況[3]，但近年來(lái)多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)心血管系統(tǒng)、代謝綜合征等多種疾病的發(fā)生均與VD缺乏密切相關(guān)[4-5]。隨著臨床對(duì)于VD的進(jìn)一步研究，發(fā)現(xiàn)血清25-（OH）D水平與兒童多種感染性疾病存在一定的相關(guān)性，并認(rèn)為通過(guò)影響機(jī)體免疫功能和炎癥反應(yīng)程度促使其對(duì)病毒易感性增加[6]。淋巴細(xì)胞是反應(yīng)機(jī)體免疫功能的重要免疫細(xì)胞群，包括T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞（NK）；而基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和IL-18均是反映細(xì)胞炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)。Zhou JF[7]等人研究發(fā)現(xiàn)EV71型感染HFMD患兒體內(nèi)T淋巴細(xì)胞亞群以及NK細(xì)胞比例隨病情加重呈逐步減少趨勢(shì)。但目前仍缺乏關(guān)于EV71型HFMD患兒VD缺乏與免疫功能關(guān)系的系統(tǒng)分析，基于此，本研究通過(guò)探討血清25-（OH）D水平與其細(xì)胞免疫功能的相關(guān)性，以進(jìn)一步證實(shí)兩者間的關(guān)聯(lián)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇本院2019年2月至2021年2月診治的78例EV71型HFMD患兒作為研究組。納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴符合HFMD診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]；⑵外周血EV71-IgM和咽拭子或肛拭子EV71核酸檢測(cè)均為陽(yáng)性；⑶病程低于5 d；⑷患兒臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴合并血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等嚴(yán)重基礎(chǔ)疾病者；⑵合并其他出疹性疾??；⑶近3個(gè)月內(nèi)注射過(guò)大劑量VD制劑；⑷近期存在免疫抑制劑或免疫增強(qiáng)劑使用史。另選擇同期健康兒童85例作為對(duì)照組。研究組男41例，女37例；年齡1～8歲，平均（3.27±1.16）歲；疾病嚴(yán)重程度：普通型53例，重癥型25例。對(duì)照組男例，女例；年齡1～9歲，平均（3.52±1.39）歲。兩組研究對(duì)象一般資料比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

1.2 方法 研究組患兒于入院次日清晨采集空腹靜脈血2 ml+2 ml[2 ml用于檢測(cè)血清25-（OH）D水平，另2 ml用于檢測(cè)免疫功能]，對(duì)照組兒童于體檢當(dāng)日采集。采用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)血清25-（OH）D水平，儀器為自動(dòng)化免疫分析儀，試劑盒由山東英盛生物技術(shù)有限公司提供。具體操作步驟如下：將樣本室溫下靜置30 min，以3000 r/min的速度離心10 min，取上清液，采用自動(dòng)化免疫分析儀自動(dòng)檢測(cè)，并記錄結(jié)果。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群水平，具體方法：將50μl混勻全血標(biāo)本與帶有熒光標(biāo)記的單克隆抗體10μl置于試管，室溫避光孵育20 min，加入溶血素250 μl，混勻，1800 r/min離心5 min，棄去上清液，加磷酸鹽緩沖液250μl，混勻，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）和IL-18水平，試劑盒由廈門慧嘉生物科技有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)，均經(jīng)過(guò)正態(tài)分析及方差齊性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以表示，行t檢驗(yàn)；采用Pearson相關(guān)性分析血清25-（OH）D與免疫功能指標(biāo)相關(guān)性；采用受試者工作特征曲線（ROC）分析血清25-（OH）D與免疫功能指標(biāo)對(duì)于EV71型HFMD患兒重癥化風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)價(jià)值；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組血清25-（OH）D水平以及免疫功能比較研究組患兒血清25-（OH）D、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+水平均顯著低于對(duì)照組，NK、MMP-9、IL-1β和IL-18水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 兩組血清25-（OH）D水平以及免疫功能比較（±s）

表1 兩組血清25-（OH）D水平以及免疫功能比較（±s）

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2.2 不同疾病嚴(yán)重程度血清25-（OH）D水平以及免疫功能比較 重癥型患兒血清25-（OH）D、CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+水平均顯著低于輕癥型，NK、MMP-9、IL-1β和IL-18水平顯著高于輕癥型（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 不同疾病嚴(yán)重程度血清25-（OH）D水平以及免疫功能比較（±s）

表2 不同疾病嚴(yán)重程度血清25-（OH）D水平以及免疫功能比較（±s）

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2.3 血清25-（OH）D與免疫功能指標(biāo)相關(guān)性 血清25-（OH）D與CD4+、CD8+呈正相關(guān)，與NK呈負(fù)相關(guān)（P＜0.05），與CD4+/CD8+之間無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05）。見(jiàn)表3、圖1-6。

圖1 血清25-（OH）D與CD4+相關(guān)性

表3 血清25-（OH）D與免疫功能指標(biāo)相關(guān)性

2.4 血清25-（OH）D與細(xì)胞免疫功能指標(biāo)對(duì)于EV71型HFMD患兒重癥化風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)價(jià)值 血清25-（OH）D與CD4+、CD8+、CD4+/CD8+、NK、MMP-9、IL-1β、IL-18均對(duì)EV71型HFMD患兒重癥化風(fēng)險(xiǎn)具有較好的預(yù)測(cè)價(jià)值，其截?cái)嘀捣謩e為≤37.74 ng/ml、≤26.49%、≤18.41%、≤1.14、＞26.26%、＞95.78 ug/L、＞43.72 ng/L、＞66.25 ng/L，其中以IL-1β、IL-18的AUC值最高（P＜0.05）。見(jiàn)表4、圖7。

表4 血清25-（OH）D與免疫功能指標(biāo)對(duì)于EV71型HFMD患兒重癥化風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)價(jià)值

圖7 EV71型HFMD患兒重癥化風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)曲線

3 討論

HFMD好發(fā)于夏秋季節(jié)，近年來(lái)，我國(guó)HFMD發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)，已成為威脅兒童健康的嚴(yán)重衛(wèi)生問(wèn)題，也為家庭以及社會(huì)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前已有研究表明，異常的免疫炎性反應(yīng)促使EV71型感染HFMD病情進(jìn)展[9]，但EV71感染后的宿主獲得性免疫反應(yīng)，尤其是T淋巴細(xì)胞的變化，目前尚不明了。25-（OH）D水平缺乏或不足已被發(fā)現(xiàn)在抗感染、正常免疫功能的維持等方面具有重要意義，國(guó)內(nèi)部分學(xué)者發(fā)現(xiàn)血清25-（OH）D缺乏與感染性疾病患兒免疫功能降低密切相關(guān)[10]，但對(duì)于EV71型感染的HFMD患兒尚缺乏研究。

圖2 血清25-（OH）D與C84+相關(guān)性

圖3 血清25-（OH）D與NK相關(guān)性

圖4 血清25-（OH）D于MMP-9相關(guān)性

圖5 血清25-（OH）D與IL-1β相關(guān)性

圖6 血清25-（OH）D與IL-18相關(guān)性

VD不僅可促進(jìn)兒童生長(zhǎng)發(fā)育，還是一種免疫調(diào)節(jié)劑，具有調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的生長(zhǎng)以及分化的作用。目前多位研究者發(fā)現(xiàn)25-（OH）D的缺乏是一些感染相關(guān)性疾病的危險(xiǎn)因素，甚至與膿毒癥等危重癥患兒死亡密切相關(guān)，增加了疾病的嚴(yán)重程度[11]。EV71型HMFD發(fā)病人群以5歲一下嬰幼兒為主，與VD缺乏好發(fā)年齡段相似。Ke Y[12]等人研究發(fā)現(xiàn)EV71型HFMD發(fā)病與感染后固有免疫以及適應(yīng)性免疫功能紊亂相關(guān)，而VD的抗感染作用也是通過(guò)固有免疫以及適應(yīng)性免疫的調(diào)節(jié)作用發(fā)揮。本研究結(jié)果顯示研究組、重癥型患兒血清25-（OH）D水平顯著低于對(duì)照組、普通型，提示EV71型HFMD的發(fā)生、發(fā)展與VD缺乏密切相關(guān)。分析其原因可能為，VD受體可在活化的T細(xì)胞上表達(dá)，當(dāng)VD缺乏或不足時(shí)，表達(dá)VD受體的T細(xì)胞減少，進(jìn)而導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低，抗病毒能力降低，促使疾病發(fā)生發(fā)展[13]；EV71型HFMD的發(fā)生會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)和心肺功能受損，VD缺乏或不足會(huì)導(dǎo)致能表達(dá)VD受體的組織受到抑制，而VD受體基因缺乏后會(huì)導(dǎo)致機(jī)體對(duì)感染性疾病以及自身免疫性疾病的易感性增加。Fisher SA[14]等人研究表明兒童檢測(cè)血清25-（OH）D水平缺乏或不足時(shí)，其患HFMD的概率大幅度增加，也證明了本研究觀點(diǎn)。

機(jī)體炎癥反應(yīng)的過(guò)度激活以及抗病毒免疫防御功能在病毒感染性疾病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中具有重要作用。EV71型HFMD患兒固有免疫呈紊亂狀態(tài)，因EV71入侵后在NK細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞上大量復(fù)制，同時(shí)其入侵可激活固有免疫細(xì)胞，誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫抵抗病原。有學(xué)者對(duì)HFMD患兒的淋巴細(xì)胞亞群分析，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞免疫、體液免疫功能均下降[15]。國(guó)外也有研究發(fā)現(xiàn)EV71型HFMD感染后，細(xì)胞免疫因子出現(xiàn)低水平甚至抑制狀態(tài)，并認(rèn)為細(xì)胞免疫在該病的重癥化中起著重要作用[16]。本研究中，研究組、重癥型患兒CD4+、CD8+以及CD4+/CD8+水平均顯著低于對(duì)照組、普通型，NK、MMP-9、IL-1β、IL-18水平顯著高于對(duì)照組、普通型，也提示EV71型HFMD患兒存在免疫功能抑制以及炎癥反應(yīng)過(guò)度激活狀態(tài)，且與該病重癥化關(guān)系密切，進(jìn)一步證實(shí)了既往研究結(jié)果。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)VD與免疫功能、炎癥反應(yīng)的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示血清25-（OH）D與CD4+、CD8+呈正相關(guān)，與NK、MMP-9、IL-1β、IL-18呈負(fù)相關(guān)，與CD4+/CD8+之間無(wú)顯著相關(guān)性，提示血清25-（OH）D水平降低可影響EV71型HFMD患兒細(xì)胞免疫功能和炎癥反應(yīng)。究其原因，EV71入侵宿主后會(huì)降低免疫細(xì)胞活性，導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞亞群降低，同時(shí)VD可調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答，大量的VD消耗，導(dǎo)致血清25-（OH）D水平降低；血清25-（OH）D水平降低可反映宿主防御、炎癥反應(yīng)等功能降低，難以全面抵抗病原菌，從而導(dǎo)致增加?jì)胗變阂赘行砸约安∏槌潭葒?yán)重性[17]；VD可促進(jìn)白細(xì)胞激素的產(chǎn)生，促使活化CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞，使其與VD受體結(jié)合，故血清25-（OH）D降低可導(dǎo)致T淋巴細(xì)胞活化受到抑制，降低患兒免疫系統(tǒng)的保護(hù)作用。此外，EV71侵入機(jī)體可激活體內(nèi)的炎癥反應(yīng)，促使炎癥細(xì)胞因子的過(guò)度釋放并損傷全身多處器官組織，最終增加HFMD的重癥化風(fēng)險(xiǎn)。既往有學(xué)者研究也表明危重癥HFMA患兒存在MMP-9等炎癥因子水平明顯升高現(xiàn)象[18]，與本研究結(jié)果相一致。本研究通過(guò)ROC曲線分析，也發(fā)現(xiàn)血清25-（OH）D、T淋巴細(xì)胞亞群以及、MMP-9、IL-1β、IL-18均可較好的預(yù)測(cè)EV71型HFMD患兒重癥化風(fēng)險(xiǎn)，為臨床及時(shí)干預(yù)治療可提供一定的參考。但本研究仍存在不足之處，因近年來(lái)本院HFMD的救治技術(shù)較前明顯提高，危重癥以及死亡患兒較少無(wú)法進(jìn)行分組，故將其合并于重癥組內(nèi)，后續(xù)將繼續(xù)研究；同時(shí)血清25-（OH）D以及免疫功能指標(biāo)的臨界值仍需要通過(guò)前瞻性研究驗(yàn)證其可靠性，以探索其對(duì)于EV71型HFMD發(fā)生發(fā)展的預(yù)警價(jià)值。

綜上所述，EV71型HFMD血清25-（OH）D水平與免疫功能呈正性相關(guān)，與炎癥細(xì)胞因子呈負(fù)相關(guān)，三者均與疾病重癥化相關(guān)，且可作為該病重癥化的預(yù)警因素。監(jiān)測(cè)血清25-（OH）D、免疫功能指標(biāo)以及炎癥細(xì)胞因子水平對(duì)評(píng)估EV71型HFMD患兒嚴(yán)重程度、提高干預(yù)具有重要意義。