間接免疫熒光法檢測血小板相關(guān)抗體新判讀標(biāo)準(zhǔn)的建立和評價

楊細(xì)媚，萬祥輝，黃超，付晶晶，劉志強(qiáng)，柯江維

（1.江西省兒童醫(yī)院檢驗科，2.腫瘤醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006）

血小板具有復(fù)雜的抗原系統(tǒng),包括與其它組織或細(xì)胞所共有的抗原,如ABO血型系統(tǒng)抗原和人類白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)；血小板特異性抗原(human platelet antigen，HPA)等[1]，而輸血，感染等因素可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生血小板抗體，導(dǎo)致相應(yīng)疾病的產(chǎn)生[2-3]。目前研究較多的血小板自身抗體有兩類：一類是針對HLA類抗原的抗體，即血小板表面相關(guān)抗體 (platelet associated immunoglobulin,PAIg)；一類是針對血小板糖蛋白的血小板特異性抗體[4-5]。本研究采用修正判讀標(biāo)準(zhǔn)后的間接免疫熒光法(indirect immunofluorescence assay,IIF)檢測PAIg。現(xiàn)對新標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評估，確定其可靠性，了解其在免疫性血小板減少癥(immune thrombocytopenia,ITP)和紅斑狼瘡(lupus erythematosus,SLE)相關(guān)臨床疾病中的診斷意義，及與流式細(xì)胞儀法(flow cytometry method,FCM)的符合率。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集2020年全年江西省兒童醫(yī)院確診的ITP患兒261例，男154例，女107例，平均年齡3.51歲；SLE患兒50例，男8例，女52例，平均年齡12.69歲，為實驗組。AA患兒50例為病例對照組，男19例，女31例，平均年齡5.38歲。正常體檢兒童50例為正常對照組，男30例，女性20例，平均年齡3.50歲。

1.2 儀器與試劑 萊卡熒光顯微鏡。 BD FACSCantoⅡ流式細(xì)胞儀。血小板抗體間接免疫熒光法檢測試劑盒購于歐蒙診斷試劑有限公司。CD61，F(xiàn)ITC-IgG購于BD公司。

1.3 檢測方法 IIF法檢測PAIg，以修正前后的新舊標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行兩次判讀，對兩次結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。然后用FCM檢測PAIg，對兩組方法檢測的一致性進(jìn)行分析。

1.3.1 IIF法檢測PAIg按試劑說明書的檢測方法進(jìn)行操作。結(jié)果判讀：將原來的判讀標(biāo)準(zhǔn)“與陽性對照結(jié)果一致判斷為陽性”修正為“血小板著染均一熒光，以熒光強(qiáng)度大于或等于陽性對照稀釋3倍后的熒光強(qiáng)度判斷為陽性”。

1.3.2 FCM檢測PAIg抽取EDTA-K2抗凝血，分離富血小板血漿(platelet rich plasma,PRP)，用PBS洗滌3遍，-20℃保存待測。每管分別加入3μl鼠抗人CD61-PE，l0μl羊抗IgG-FITC單克隆抗體避光孵育15 min,PBS緩沖液洗滌后，離心5 min，再用4%的甲醛溶液重懸，以CD61對血小板設(shè)門上流式細(xì)胞儀檢測。結(jié)果判斷：采用CellQuestPro軟件分析。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 采用SSPS 24.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，對新舊兩種判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行配對χ2檢驗。IIF和FCM兩種檢測方法采用Kappa一致性分析及McNemer檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IIF檢測PAIg在ITP和SLE診斷中的意義以臨床診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)，使用新的判讀標(biāo)準(zhǔn)后，ITP和SLE患兒PAIg的陽性率分別從19.54%(51/261)上升到62.07%(162/261)和16.00%(8/50)上升到38.00%(19/50)。新舊標(biāo)準(zhǔn)的陽性率有統(tǒng)計學(xué)差異 (P=0.000)，總的診斷效率從45.01%上升到67.64%(P=0.000)。研究發(fā)現(xiàn)其中17例持續(xù)性和慢性ITP患兒治療后PAIg陽性率為29.42%(5/17)，遠(yuǎn)低于急性組ITP患兒64.34%(157/244)，見表1。AA組中PAIg的陽性率從修正前的14.00%(7/50)上升到修正后的28.00%(14/50)，正常對照組中，修正標(biāo)準(zhǔn)前后均為1例陽性。

表1 IIF法檢測PAIg新舊判讀標(biāo)準(zhǔn)的方法學(xué)評價（%）

2.2 各組PAIg在兩種方法中的一致性分析 IIF法在ITP患兒中PAIg陽性率為64.00%(32/50)，F(xiàn)CM法陽性率為74.00%(37/50)，IIF法與FCM法的符合率為88.00%。通過McNemer檢驗(P=0.125)，提示兩種方法診斷情況一致;Kappa值為0.680，提示兩種方法診斷結(jié)果存在一致性。IIF法在SLE患兒的陽性率為38.00%(19/50)，F(xiàn)CM法陽性率為34.00% (17/50)，IIF法與FCM法的符合率為84.00%。通過McNemer檢驗(P=0.727)，提示兩種診斷方法無差異；Kappa值0.653提示兩種方法診斷結(jié)果存在一致性。見表2。IIF在50例AA患兒中檢出14例PAIg，F(xiàn)CM法檢出12例，IIF法與FCM法的符合率88.00%。通過McNemer檢驗(P=0.375)，提示兩種方法診斷情況一致，Kappa值為0.733，提示兩種方法診斷結(jié)果一致性較好。正常對照組中，IIF法檢出1例PAIg，F(xiàn)CM全陰，兩種方法的符合率為98.00%。見表3。

表2 ITP組和SLE組兩種檢測方法的一致性分析

表3 AA組和正常對照組兩種方法的一致性分析

3 討論

ITP是兒童常見的出血性疾病之一，國內(nèi)外研究報道血小板自身抗體的檢測在ITP鑒別診斷和療效中有較高的應(yīng)用價值[6-8]。血小板抗體檢測方法較多，常用的有血小板粘附免疫熒光實驗(platelet adhesion immunofluorescence test,PAIFT)、酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)，F(xiàn)CM等。PAIFT方法簡單，是較早的敏感方法，1986年國際血小板血清學(xué)研討會曾將其作為參考方法,并規(guī)定任何新的血小板抗體檢測方法均應(yīng)與其進(jìn)行比較[9]。ELISA是現(xiàn)今國內(nèi)外應(yīng)用最普遍的方法，但其敏感性和特異性均較低。近年來FCM法檢測PAIg在國內(nèi)外臨床逐步推廣使用，比較成熟[10-11]。本研究采用IIF法，其原理類似PAIFT法，說明書的判讀標(biāo)準(zhǔn)為“與陽性對照一致判為陽性”，故判讀時以陽性對照的熒光強(qiáng)度為標(biāo)準(zhǔn)，與陽性對照一致判斷為陽性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)陽性率很低。通過與公司商討對判讀標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行具體化解讀：“血小板著染均一熒光，熒光模型與陽性對照一致，但熒光強(qiáng)度需進(jìn)一步摸索，本研究以陽性對照稀釋3倍的熒光強(qiáng)度進(jìn)行判斷”。陽性率得到大幅提升，且與FCM進(jìn)行Kappa一致性分析得出兩種方法的結(jié)果一致，符合率較好。本研究發(fā)現(xiàn)急性ITP患兒的PAIg陽性率明顯高于慢性或者經(jīng)過治療后的，可能是由于治療抑制了抗體的產(chǎn)生，導(dǎo)致抗體水平降低。由此可見，檢測PAIg可成為鑒別急慢性ITP和隨訪患者的有用工具，與Salah Aref等[12]報道的結(jié)果一致。血小板相關(guān)抗原與其他細(xì)胞或組織存在共有抗原，故自身免疫性疾病如SLE患者體內(nèi)亦可檢測出PAIg[13]。本實驗方法檢測SLE組患兒的PAIg陽性率明顯低于李敏等[14]的報道，可能原因在于本研究人群為SLE患兒，而其研究人群為SLE伴血小板減少的患者。SLE組檢測PAIg陽性結(jié)果的熒光強(qiáng)度常強(qiáng)于ITP組患兒，推測SLE組患兒本身存在其他的自身抗體。AA組用IIF法檢測的陽性率亦較高，但與FCM檢測的陽性率接近，可見AA組出現(xiàn)的假陽性率不是由于方法學(xué)的原因?qū)е?。有研究報道[15]AA組患兒PAIg水平增高，表明這部分患者體內(nèi)存在針對自身血小板抗原的自身免疫反應(yīng)，還有研究報道[16]AA組患兒體內(nèi)血小板抗體與多次輸血有關(guān)。本研究AA組的14例患兒中有10例有2次以上輸血史?？傊?，與FCM法比較，IIF法不需要對標(biāo)本進(jìn)行血小板富集，洗滌等前期處理，整個操作過程簡單，耗時短，成本低廉。尤其針對血小板數(shù)量少的患兒來說更合適，因為IIF法檢測PAIg所需標(biāo)本量很少，且不受標(biāo)本中血小板數(shù)量影響，提高了因采血困難和采血量大患兒家屬的滿意度。

本實驗采用修正判讀標(biāo)準(zhǔn)后，IIF法陽性率得到大的提升，但總的陽性率在ITP患兒中還有待提高，特異性較一般。而且因是人工判讀，結(jié)果存在主觀差異，難以標(biāo)準(zhǔn)化。但由于其操作簡便，標(biāo)本需要量少，患兒家屬易于接受，與FCM的符合率較好，IIF更適合對ITP患兒的PAIg進(jìn)行篩查診斷。