某血液質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室參加CITIC血液成分細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果分析

樊璐

（江西省血液中心，江西 南昌 330052）

輸血傳播性疾病(TTI)包括輸血傳播病毒感染(TTVI)、輸血傳播細(xì)菌感染(TTBI)、輸血傳播病原蟲感染(TTPI)。血液制品細(xì)菌污染可導(dǎo)致TTBI，引發(fā)患者輸血不良反應(yīng)甚至死亡等嚴(yán)重后果，是輸血安全領(lǐng)域的重要問題?！度俺煞盅|(zhì)量監(jiān)測(cè)指南》[1]規(guī)定無菌試驗(yàn)是全血及各類成分血須開展的血液質(zhì)量控制檢查項(xiàng)目，血液制品質(zhì)量抽檢無菌試驗(yàn)符合性目標(biāo)為符合率100%。針對(duì)采供血機(jī)構(gòu)工作需求，自2013年起中國(guó)國(guó)際輸血感染預(yù)防和控制(China International Transfusion Infection Control，CITIC)項(xiàng)目組建立血液成分細(xì)菌檢測(cè)能力驗(yàn)證項(xiàng)目[2]，客觀評(píng)估參評(píng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)血液成分中細(xì)菌的檢測(cè)能力。本血液質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室于2015年起參加該項(xiàng)質(zhì)評(píng)?，F(xiàn)對(duì)近3年本室參評(píng)結(jié)果進(jìn)行分析總結(jié)，報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 2019年3月至2021年6月CITIC項(xiàng)目組郵寄的細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)樣品，由上海市血液中心質(zhì)量與法規(guī)部質(zhì)控科制備,樣品批號(hào)為2019-04-17、2019-07-17、2019-10-23、2020-04-22、2020-07-15、2021-04-16、2021-07-14。質(zhì)評(píng)項(xiàng)目代碼BTBS4310。每次質(zhì)評(píng)活動(dòng)常溫運(yùn)輸發(fā)放凍干狀態(tài)樣品10支，細(xì)菌陽性樣品由商品化的標(biāo)準(zhǔn)菌株(生物梅里埃公司)經(jīng)連續(xù)稀釋而來，陰性樣品采用無菌無熱原的小牛血清。復(fù)溶用無菌檢測(cè)用水、無菌生理鹽水隨同樣品發(fā)放。本實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)人員接收質(zhì)評(píng)物時(shí)進(jìn)行外觀檢查，查看樣品、試劑均無破損、無污染，核對(duì)數(shù)量無誤，放置于2～8℃冰箱保存并盡快接種。

1.2 儀器與試劑 儀器設(shè)備：BacT/ALERT 3D全自動(dòng)細(xì)菌/分枝桿菌培養(yǎng)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)(生物梅里埃公司)、潔凈度百級(jí)凈化工作臺(tái)(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)，儀器設(shè)備每年定期校準(zhǔn)檢定。試劑：需氧培養(yǎng)瓶BPA(生物梅里埃公司)、無菌檢測(cè)用水、無菌生理鹽水(0.9%氯化鈉溶液)、5 ml/10 ml一次性使用無菌注射器、安爾碘消毒劑、醫(yī)用棉簽。

1.3 方法

1.3.1 檢測(cè)方法 室間質(zhì)評(píng)樣品及配套試劑通過實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部傳遞窗傳送至凈化室，在凈化臺(tái)中進(jìn)行無菌操作。使用醫(yī)用棉簽蘸取安爾碘消毒劑擦拭樣品瓶和配套試劑外表面，消毒樣品瓶膠墊上的進(jìn)針部位。用注射器吸取2 ml無菌檢測(cè)用水注入樣品瓶復(fù)溶凍干粉，放置至充分溶解后，再加入2 ml生理鹽水混勻。每支樣品接種需氧培養(yǎng)瓶1瓶。接種后的需氧培養(yǎng)瓶在0.5 h內(nèi)加載至實(shí)驗(yàn)室日常使用的微生物培養(yǎng)系統(tǒng)，37℃孵育7 d。

1.3.2 結(jié)果判定 培養(yǎng)過程中，若培養(yǎng)儀發(fā)出反應(yīng)性信號(hào)，查看儀器中相應(yīng)培養(yǎng)瓶的細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，記錄報(bào)陽時(shí)間。培養(yǎng)結(jié)束后，觀察陽性培養(yǎng)瓶渾濁、底部變色情況。連續(xù)監(jiān)測(cè)7 d未產(chǎn)生反應(yīng)性信號(hào)的培養(yǎng)瓶判為陰性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 血液篩查細(xì)菌檢測(cè)為定性檢測(cè)。根據(jù)CITIC項(xiàng)目秘書處歷次發(fā)布的《血液成分細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果報(bào)告》，將本室定性檢測(cè)結(jié)果與樣品陰性/陽性參考結(jié)果相比較，將本室陽性樣品檢出時(shí)間與相同檢測(cè)系統(tǒng)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)時(shí)間均值及標(biāo)準(zhǔn)差(SD)進(jìn)行比對(duì)。檢測(cè)結(jié)果符合率=總檢測(cè)數(shù)中符合參考結(jié)果數(shù)/總檢測(cè)數(shù)×100%。陽性樣品檢出時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差指數(shù)(SDI)值=(x-x)/SD，x為本室檢出時(shí)間，x為具備相同檢測(cè)系統(tǒng)(BioMerieux BacT/ALERT BPA)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室的平均檢出時(shí)間。

2 結(jié)果

2.1 2019年第1次參加CITIC細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果 本室9份室間質(zhì)評(píng)樣品檢測(cè)結(jié)果與參考結(jié)果一致，樣品F出現(xiàn)假陽性結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果符合率90%。見表1。

表1 2019年第1次參加CITIC細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果

2.2 2019年第2次參加CITIC細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果 本室10份室間質(zhì)評(píng)樣品檢測(cè)結(jié)果與參考結(jié)果一致，檢測(cè)結(jié)果符合率100%。見表2。

表2 2019年第2次參加CITIC細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果

2.3 2019年第3次參加CITIC細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果 除樣品D和E被CITIC項(xiàng)目組撤回，不作分析評(píng)價(jià)，檢測(cè)結(jié)果符合率100%。見表3。

表3 2019年第3次參加CITIC細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果

2.4 2020年第1次參加CITIC細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果 除樣品A和E因設(shè)備故障未完成培養(yǎng)，無法給出結(jié)果，CITIC項(xiàng)目組已將本室從樣品A和E的統(tǒng)計(jì)分析中去除，檢測(cè)結(jié)果符合率100%。見表4。

表4 2020年第1次參加CITIC細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果

2.5 2020年第2次參加CITIC細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果 教育型樣品E菌液濃度較低，本室未檢出，檢測(cè)結(jié)果符合率90%。見表5。

表5 2020年第2次參加CITIC細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果

2.6 2021年第1次參加CITIC細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果 教育型樣品E菌液濃度較低，本室未檢出，檢測(cè)結(jié)果符合率90%。見表6。

表6 2021年第1次參加CITIC細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果

2.7 2021年第2次參加CITIC細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果 樣品H出現(xiàn)假陰性結(jié)果，檢測(cè)結(jié)果符合率90%。見表7。

表7 2021年第2次參加CITIC細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)結(jié)果

2.8 陰性/陽性符合率 2019年3月至2021年7月本室檢測(cè)CITIC血液成分細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)樣品的陰性符合率為94.12%(16/17)；陽性符合率為93.88%(46/49)，其中教育型樣品未檢出2例。

2.9 陽性樣品檢出時(shí)間的標(biāo)準(zhǔn)差指數(shù)評(píng)價(jià) 2019年3月至2021年7月本室檢出CITIC血液成分細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)陽性樣品46份，陽性樣品細(xì)菌檢出時(shí)間優(yōu)良率91.30%(42/46)；2020年第1次質(zhì)評(píng)教育型樣品J本室檢出時(shí)間(22.32 h)顯著低于參評(píng)實(shí)驗(yàn)室平均檢出時(shí)間(75.32h)，SDI<-3。見表8。

表8 46份陽性樣品細(xì)菌檢出時(shí)間SDI值分布情況

3 討論

血液成分的細(xì)菌污染是輸血后感染的主要風(fēng)險(xiǎn)之一,尤其是單采血小板保存溫度為20～24℃，為細(xì)菌生長(zhǎng)提供有利條件。細(xì)菌污染及膿毒性輸血反應(yīng)是血小板輸注面臨的重要風(fēng)險(xiǎn)[3]。何華慶等[4]報(bào)道血小板細(xì)菌篩檢可有效預(yù)防和控制血小板制品細(xì)菌污染。《中國(guó)藥典》[5]規(guī)定作為驗(yàn)證無菌檢查所用培養(yǎng)基靈敏度的標(biāo)準(zhǔn)菌種包含白色念珠菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉、枯草芽孢桿菌等。CITIC項(xiàng)目組樣本設(shè)計(jì)方案對(duì)菌種選擇、濃度匹配均有考量。選取上述代表性菌種作為血液成分細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)樣品的標(biāo)準(zhǔn)菌種，能夠有效監(jiān)測(cè)采供血機(jī)構(gòu)全自動(dòng)微生物檢測(cè)系統(tǒng)性能。

2019年第1次室間質(zhì)評(píng)本室出現(xiàn)1例樣品F假陽性檢測(cè)結(jié)果，本次質(zhì)評(píng)樣品A和F為同一批制備的無菌樣品，樣品A本室檢測(cè)為陰性。無菌樣品F假陽性原因推測(cè)是接種過程中發(fā)生交叉污染。邱穎婕等[2]經(jīng)研究提示操作人員應(yīng)注意在接種時(shí)勿將標(biāo)本液體打向空氣中或殘留于接種環(huán)境，尤其是殘留在操作人員手部，以避免交叉污染造成假陽性結(jié)果。

2020年第2次、2021年第1次室間質(zhì)評(píng)本室未檢出濃度20CFU/ml白色念珠菌、30 CFU/ml表皮葡萄球菌教育型樣品。此2次質(zhì)評(píng)活動(dòng)中，BioMerieux BacT/ALERT BPA檢測(cè)系統(tǒng)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)于教育型樣品的檢測(cè)結(jié)果符合率分別為56.76%(21/37)、76.32%(29/38)，出現(xiàn)不同程度漏檢。參評(píng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)低濃度的微生物樣品檢出能力存在一定差異，CITIC項(xiàng)目組不予評(píng)價(jià)教育型樣品檢測(cè)結(jié)果。教育型樣品濃度接近檢測(cè)范圍下限，對(duì)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)設(shè)備和檢測(cè)系統(tǒng)的性能要求更加嚴(yán)格[6]。徐蓓等[7]報(bào)道BacT/ALERT 3D和BD系列檢測(cè)系統(tǒng)較Thermo REDOX 1系統(tǒng)發(fā)生不符合結(jié)果的比例小。許清[8]報(bào)道不同檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)不同菌種的檢測(cè)能力有所差異，BacT/ALERT 3D系統(tǒng)對(duì)于某些品種的教育型樣品檢出率偏低。

2021年第2次室間質(zhì)評(píng)本室出現(xiàn)1例樣品H假陰性結(jié)果，相同檢測(cè)系統(tǒng)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室對(duì)此份樣品的檢測(cè)結(jié)果符合率為70.27%(26/37)。本室查找檢測(cè)和樣品保存過程中存在的異常情況，分析原因如下：⑴在抽取樣品H菌液的實(shí)驗(yàn)過程中，樣品瓶中負(fù)壓較大，反復(fù)吸樣操作使注射器中的菌液重返樣品瓶中，生成大量氣泡，導(dǎo)致接種吸取量不足。⑵朱立葦?shù)萚9]報(bào)道保存運(yùn)輸不當(dāng)會(huì)造成室間質(zhì)評(píng)樣品中部分細(xì)菌死亡。此次質(zhì)評(píng)時(shí)間為夏季，樣品在室外高溫環(huán)境下保存運(yùn)輸數(shù)天，可能發(fā)生細(xì)菌活性降低、細(xì)菌死亡現(xiàn)象。CITIC項(xiàng)目組提示凍干狀態(tài)樣品檢測(cè)前的復(fù)溶過程很重要，注入復(fù)溶液后，放置數(shù)分鐘至凍干粉完全溶解，避免氣泡產(chǎn)生，再加入稀釋液，充分混勻后接種。為確保陽性樣品檢出率，接種時(shí)應(yīng)將樣品液體全部注入培養(yǎng)瓶。

從質(zhì)評(píng)陽性樣品反應(yīng)性信號(hào)出現(xiàn)的時(shí)間分析，超過90%檢測(cè)值處于參考檢測(cè)時(shí)間均值±2SD范圍之內(nèi)，表明本室檢測(cè)系統(tǒng)受控。2020年第1次室間質(zhì)評(píng)教育型樣品J(20CFU/ml黑曲霉菌)是低濃度的真菌樣品，全國(guó)參評(píng)實(shí)驗(yàn)室樣品J中微生物的平均檢出時(shí)間延長(zhǎng)、變異較大，本室檢出時(shí)間顯著低于相同檢測(cè)系統(tǒng)平均檢出時(shí)間。此份樣品本室檢測(cè)結(jié)果與朱立葦?shù)萚9]報(bào)道其實(shí)驗(yàn)室2013年第2次室間質(zhì)評(píng)樣品B(50CFU/ml黑曲霉菌)的檢出時(shí)間(19.8 h)比平均檢出時(shí)間(53.1 h)明顯偏短的情況相似，推測(cè)可能與樣品中微生物的活性或濃度的均勻性相關(guān)。

2020年第1次室間質(zhì)評(píng)本室有2份樣品因設(shè)備發(fā)生電路故障未完成培養(yǎng)，提示我們?cè)O(shè)備硬件和軟件的定期維護(hù)保養(yǎng)十分必要。CITIC血液成分細(xì)菌檢測(cè)室間質(zhì)評(píng)項(xiàng)目是實(shí)驗(yàn)室評(píng)估自身檢測(cè)能力的方式之一，通過檢測(cè)結(jié)果比對(duì)，了解參評(píng)實(shí)驗(yàn)室之間、不同檢測(cè)系統(tǒng)之間的水平差異，從而持續(xù)監(jiān)控和改進(jìn)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平[7]。本質(zhì)控實(shí)驗(yàn)室細(xì)菌檢測(cè)水平達(dá)標(biāo)，滿足日常血液成分無菌試驗(yàn)工作需求，對(duì)于低濃度細(xì)菌教育型樣品的檢出能力有待進(jìn)一步提升。通過分析不符合結(jié)果產(chǎn)生的原因，總結(jié)經(jīng)驗(yàn)、發(fā)現(xiàn)不足，進(jìn)而采取改進(jìn)措施，提高檢測(cè)能力。采供血機(jī)構(gòu)應(yīng)加強(qiáng)“人、機(jī)、料、法、環(huán)、測(cè)”血站實(shí)驗(yàn)室管理要素[10]監(jiān)控，確保質(zhì)量管理體系有效運(yùn)行，保障血液制品臨床輸注安全。