貪食邁阿密蟲（M. avidus）對(duì)4 種海水養(yǎng)殖魚類組織勻漿液的趨化性

林能鋒 陳立志 曾 紅＊

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所 福州 350003；2.福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院南方海洋研究院 福州 350007)

感染大黃魚的纖毛蟲主要有剌激隱核蟲（Crypotocaryon irritans）、淀粉卵渦鞭蟲和盾纖毛蟲，是對(duì)大黃魚人工養(yǎng)殖造成嚴(yán)重危害的一大類病原[1]。 曾有報(bào)道， 刺激隱核蟲導(dǎo)致的平均發(fā)病率在30%～100%，局部死亡率也達(dá)到80%[2]。大黃魚魚苗感染淀粉卵渦鞭蟲的死亡率可達(dá)75%～100% ，成魚死亡率50%～70%[3-4]。 盾纖毛蟲被認(rèn)為是一種兼性的機(jī)會(huì)性寄生蟲，常造成海水養(yǎng)殖動(dòng)物的感染，在世界范圍內(nèi)對(duì)養(yǎng)殖魚類造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[5]。 貪食邁阿密蟲（M. avidus）、海洋尾絲蟲（Uronema marinum）和水滴偽康纖蟲（Pseudocohnilembus persalinus）是最常見的感染海水養(yǎng)殖動(dòng)物的致病盾纖毛蟲。近年來，由盾纖毛蟲感染大黃魚的病例發(fā)生率越來越高。 我們分離并保存了一株感染大黃魚的盾纖毛蟲， 經(jīng)鑒定為貪食邁阿密蟲（M. avidus）。

纖毛蟲受生活環(huán)境中化學(xué)物質(zhì)濃度梯度刺激的影響，能產(chǎn)生趨向性運(yùn)動(dòng)[6-7]。 魚類致病纖毛蟲的趨化特性可能與其對(duì)魚體的侵染密切相關(guān)[8]。 而目前對(duì)于盾纖類纖毛蟲對(duì)養(yǎng)殖魚類的趨化性研究尚未見相關(guān)報(bào)道。 本研究通過研究貪食邁阿密蟲對(duì)4 種海水養(yǎng)殖魚類組織勻漿液的趨化性， 推測(cè)其可能的侵染路徑，以加深對(duì)盾纖類纖毛蟲致病性的理解。

1 材料和方法

1.1 貪食邁阿密蟲 貪食邁阿密蟲 （M. avidus）為本實(shí)驗(yàn)室保存的分離自患病大黃魚蟲株。 培養(yǎng)方法參照林能鋒等[9]描述的方法，18 ℃培養(yǎng)2～3 d，蟲體培養(yǎng)密度＞5 000 ind/mL。

1.2 魚類組織勻漿的制備 大黃魚、黃姑魚和鱸魚樣品均采自寧德三都澳養(yǎng)殖漁排， 大菱鲆采自市售活體。 魚活體狀態(tài)下刮取體表黏液，加入10 倍量海水，搖勻，為體表黏液樣品。魚體尾靜脈采血，血樣置4 ℃過夜，6 000 r/min、4 ℃離心10 min， 取上清，為魚血清樣品。 其余組織勻漿液的制備如下： 解剖經(jīng)冰浴麻醉的活魚， 切取并稱量相應(yīng)組織樣品于玻璃勻漿器內(nèi)，向其中加入10 倍量的預(yù)冷海水，冰浴勻漿，勻漿液4 ℃、6 000 r/min 離心10 min，吸取上清放置4 ℃冰箱備用。

1.3 趨化性測(cè)試方法 趨化性試驗(yàn)參考鄒峰等[10]的研究方法。將進(jìn)行趨化試驗(yàn)的載玻片放置于濕盒中，18 ℃，趨化過程持續(xù)30 min 后進(jìn)行蟲體計(jì)數(shù)。 計(jì)數(shù)方法為：在液滴中加入體積比為8%的Lugol's 碘液，在光學(xué)顯微鏡（10×10）下計(jì)數(shù)液滴范圍內(nèi)的蟲體。試驗(yàn)重復(fù)5 次。對(duì)照組以過濾海水替換組織勻漿液。

1.4 趨化率計(jì)算及數(shù)據(jù)分析 趨化率（chemotaxis index，CI）=試驗(yàn)組織勻漿液中蟲體數(shù)量/蟲體總數(shù)×100%。 試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著性分析（成對(duì)雙樣本T 檢驗(yàn)）處理，分別用P＞0.05、0.01＜P＜0.05 和P＜0.01 來表示差異不顯著、差異顯著和差異極顯著。 多重比較分析應(yīng)用SPSS軟件。

2 結(jié)果與分析

貪食邁阿密蟲對(duì)大菱鲆不同組織勻漿液的趨化作用不同，貪食邁阿密蟲對(duì)眼勻漿液的趨化率最高，對(duì)腦脊液的趨化性次之， 對(duì)表皮黏液及肌肉勻漿液（與空白海水對(duì)照相比）并無明顯的趨化現(xiàn)象。 t 檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，貪食邁阿密蟲對(duì)大菱鲆的眼、腦脊液、腦、腎、鰓、肝的勻漿液表現(xiàn)出強(qiáng)烈的趨化性（P＜0.01）；對(duì)表皮黏液及肌肉勻漿液并無明顯的趨化現(xiàn)象（P＞0.05）。 見圖1。

圖1 貪食邁阿密蟲對(duì)大菱鲆不同生物組織材料的趨化性

貪食邁阿密蟲對(duì)大黃魚的腦、 眼勻漿液和血清的趨化率高（P＜0.01），表現(xiàn)出強(qiáng)烈的趨化作用；對(duì)體表黏液及鰓勻漿液的趨化率較低，但差異顯著（P＜0.05）；對(duì)肝、肌肉勻漿液的趨化率最低，趨化性差異不顯著（P＞0.05）。 見圖2。

圖2 貪食邁阿密蟲對(duì)大黃魚不同生物組織材料的趨化性

貪食邁阿密蟲對(duì)與大黃魚同屬于石首魚科的黃姑魚不同組織勻漿液的趨化試驗(yàn)結(jié)果見圖3。 貪食邁阿密蟲同樣表現(xiàn)出對(duì)黃姑魚腦脊液、腦、眼勻漿液的高趨化性（P＜0.01）；對(duì)黃姑魚的肝、腎勻漿液亦表現(xiàn)出較高的趨化率（P＜0.05）；但對(duì)肌肉、鰓、黏液勻漿液無明顯趨化現(xiàn)象（P＞0.05）。

圖3 貪食邁阿密蟲對(duì)黃姑魚不同生物組織材料的趨化性

貪食邁阿密蟲對(duì)鱸魚的眼、腦、腦脊液勻漿液表現(xiàn)出極高的趨化率差異（P＜0.01），蟲體表現(xiàn)出對(duì)上述組織勻漿液的強(qiáng)烈趨化性；對(duì)鱸魚的體表黏液、腎的勻漿液也表現(xiàn)出較高的趨化率（P＜0.01）；而對(duì)鱸魚的肌肉、鰓、肝勻漿液無明顯趨化現(xiàn)象（P＞0.05）。見圖4。

圖4 貪食邁阿密蟲對(duì)鱸魚不同生物組織材料的趨化性

比較貪食邁阿密蟲對(duì)4 種養(yǎng)殖魚類組織勻漿的趨化性，貪食邁阿密蟲表現(xiàn)出對(duì)大菱鲆、大黃魚的組織勻漿趨化性相對(duì)高于黃姑魚、鱸魚，尤其是貪食邁阿密蟲對(duì)大菱鲆、大黃魚的眼和腦組織的趨化性上，其數(shù)據(jù)結(jié)果都顯著大于黃姑魚和鱸魚， 應(yīng)用SPSS軟件進(jìn)行多重比較分析， 結(jié)果表現(xiàn)為極顯著差異（P＜0.01）。

3 討 論

貪食邁阿密蟲對(duì)4 種養(yǎng)殖魚類： 大菱鲆、 大黃魚、黃姑魚、鱸魚的眼、腦勻漿液及腦脊液表現(xiàn)出強(qiáng)烈的趨化效果，而對(duì)鰓、肝、黏液、肌肉、腎臟勻漿液的趨化率較低， 顯然貪食邁阿密蟲表現(xiàn)出對(duì)本試驗(yàn)中多種魚類的神經(jīng)組織具有顯著的趨化偏好性，而對(duì)各種魚類的內(nèi)臟組織勻漿液的趨化偏好性不明顯。 在由貪食邁阿密蟲導(dǎo)致的大黃魚死亡病例中，可在眼及腦中分離到大量盾纖蟲的存在， 患魚也明顯表現(xiàn)出游泳的無方向性， 這也與患魚的神經(jīng)系統(tǒng)受到侵染有關(guān)。 而對(duì)斑馬鯊（Stegostoma fasciatum）[11]及豹鯊（Triakis semifasciata）[12]流行病學(xué)的研究中也證實(shí)，貪食邁阿密蟲可引起腦膜腦炎，對(duì)魚體的腦、鰓、肝進(jìn)行SSU rRNA 基因的PCR 反應(yīng)，顯示只有腦組織有陽性結(jié)果，從該基因擴(kuò)增出的DNA 序列與貪食邁阿密蟲的DNA 序列完全匹配，這與本試驗(yàn)中貪食邁阿密蟲對(duì)神經(jīng)組織的趨化偏好性結(jié)果相吻合。 由于貪食邁阿密蟲侵染后期感染養(yǎng)殖魚類神經(jīng)系統(tǒng)，造成魚的游泳、攝食等重要生理活動(dòng)失調(diào)。

在貪食邁阿密蟲對(duì)魚類侵染途徑的研究中，發(fā)現(xiàn)盾纖蟲不僅可以通過血液循環(huán)和結(jié)締組織傳播[13-14]，還可以通過神經(jīng)系統(tǒng)或腦脊液循環(huán)傳播[15]。從本研究的趨化性試驗(yàn)觀察中得知， 神經(jīng)組織勻漿液與肝、腎、肌肉的勻漿液相比具有更強(qiáng)的趨化誘導(dǎo)性， 從另一方面證實(shí)貪食邁阿密蟲對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染強(qiáng)于內(nèi)臟組織器官的感染， 從而導(dǎo)致感染魚類的快速死亡。

貪食邁阿密蟲對(duì)大黃魚的血清也具有較高的趨化率，亦可解釋破鱗片、皮膚受損的魚更易受到感染的原因。 從不同魚類組織勻漿對(duì)貪食邁阿密蟲的趨化誘導(dǎo)性比較來看， 推測(cè)貪食邁阿密蟲對(duì)宿主的侵染有一定的選擇性。