生物3D打印在醫(yī)學領域的研究及應用

宋佳奇，陳海蓮，陽范文

廣州醫(yī)科大學 生物醫(yī)學工程系，廣東 廣州 511436

引言

21世紀，制造業(yè)從批量化、實用性、高效率的特征逐步向高精度、高集成和個性化發(fā)展特征轉變。三維打?。═hree‐Dimensional Printing，3DP）技術的產(chǎn)生，正好滿足這一要求。與傳統(tǒng)的工業(yè)建模技術不同，3DP采用逐層堆積的制造方式完成三維結構的構建。模型只需通過3D制圖軟件構建，方便靈巧，制備簡單，是一種新型快速成型制造技術[1]。3DP正在逐漸改變工業(yè)生產(chǎn)的方式，習近平指出“這個技術很重要，要抓緊產(chǎn)業(yè)化”。

生物三維打?。˙io‐3DP）是將生物醫(yī)學技術和3DP技術相融合，并以解決生命健康領域的科學問題、器械制造和臨床醫(yī)學需求為目的，以個性化設計和制造為特點的新興技術。生物3DP的材料主要有活細胞、生長因子和水凝膠類等；應用高精度、多組分的打印技術，結合體外細胞培養(yǎng)和組織培養(yǎng)技術等構建具有個性化或生物活性的復雜三維結構，可實現(xiàn)個性化植入體、人造骨骼、人造血管、人工器官的制造，為移植器官醫(yī)學的發(fā)展提供新的來源和途徑[2]。Bio‐3DP技術目前已在術前規(guī)劃、骨科、金屬植入物、軟組織類器官制造等醫(yī)學領域得以推廣與應用；近年來，活體細胞、體外血管的構建、人體仿生組織和器官的打印技術都已取得了實質性突破。

本文從3DP技術的類型、生物3DP的技術特點和應用展開，結合最新的生物3DP發(fā)展情況和相關領域的最新研究應用進展，分析當前該技術所面臨的問題，探討生物3DP的未來發(fā)展前景。

1 3DP技術概述

3DP技術的打印數(shù)據(jù)可以來源于物體的斷層成像或通過計算機建模軟件（3D max等）生成的三維數(shù)據(jù)模型，以STL格式輸入計算機系統(tǒng)中，分層切割形成以層為單位的切數(shù)據(jù)。打印方式有激光束打印、熱熔噴嘴打印等。打印原料包括塑料、粉末（陶瓷、金屬）、光敏樹脂、生物細胞組織等。通過二維打印平面的逐層疊加，最終堆砌出所需要的三維產(chǎn)品，必要時可進一步后處理。3DP具有制造工藝簡單、自動化程度高和設計成本低等特點，是一種快速成型的、增材制造新的新型數(shù)字化成型技術。

按打印原理的不同，3DP技術可分為三維印刷工藝、數(shù)字光處理技術、選區(qū)激光燒結技術、熔融沉積成型技術和立體光固化成型技術等。

1.1 三維印刷工藝

三維印刷工藝是采用石膏、陶瓷、金屬等粉末為原材料，與平面打印非常相似，甚至可以使用平面打印機的打印頭進行成型。與立體光固化成型技術（Stereo Lithography Apparatus，SLA）的激光燒結成型不同，零件的切面通過噴嘴用粘合劑（硅膠等）印刷在材料粉末上。打印物的每一層截面都是由片平鋪的粉末在黏合劑的作用下形成的，黏合劑通過噴頭擠出?？筛爬橐凰停ǚ郏┒仯ǚ郏┤龂娚洌ㄕ辰Y劑）。如此循環(huán)重復，最終完成一個三維粉體的粘結體[3]。

該工藝的優(yōu)點是打印速度快，不需要多余支撐；可根據(jù)所需打印物的顏色向打印材料中加入不同的顏色；冗余粉末的去除較為方便，成本低廉。缺點是力學性能差、強度低，成品表面不如立體光固化技術光潔，精細度也不佳。

1.2 數(shù)字光處理技術

數(shù)字光處理技術（Digital Light Processing，DLP）是先把影像信號經(jīng)過數(shù)字處理，然后再把光投影出來，是以選區(qū)激光燒結技術（Selective Laser Sintering，SLS）和SLA為基礎的3DP技術。利用DLP投影可見光通過液體光敏樹脂的表層，使發(fā)生聚合反應，形成投影形狀，層層投影，層層固化，最終成型出三維產(chǎn)品[4]。

其優(yōu)點是速度快、精度高，光源采用LED具有體積小、壽命長和環(huán)保等特點。其不足之處是光敏樹脂材料價格貴，固化后脆性，對于復雜的結構需要加支撐，不方便維護。

1.3 選擇性激光燒結成形技術

SLS是一種增材制造技術，使用YAG激光器或光纖激光器（100 W以上），利用計算結三維模型的切片數(shù)據(jù)來控制激光束把金屬、陶瓷等粉末材料熔化，逐層燒結、逐層疊加，再通過凝固過程堆積出密度接近100%的粉末結合體，最后進行燒結好，制得三維產(chǎn)品[5]。

SLS工藝與傳統(tǒng)技術相比，是真正意義上的自由制造，理論上傳統(tǒng)工藝無法完成的內(nèi)部形狀復雜的零件，SLS都可以完成。材料要求低，只要熔融后可以粘結都可以作為原材料。盡管SLS印刷部件表面成型件表面粗糙需打磨，但是加工零件具有高強度和剛度，有著良好的耐化學性。

1.4 熔融沉積成型技術

熔融沉積成型（Fused Deposition Modeling，F(xiàn)DM）是20世紀80年代最先提出的堆積打印技術。噴頭沿x方向移動，工作臺沿y、z軸方向移動。熱熔性材料（ABS、PLA）先從管中加入，進入噴頭并進行加熱，使其融化成為流體，計算機控制打印機再將其擠出，擠出的同時冷卻與之前的擠出物粘結，噴頭沿著切面輪廓方向一圈一圈由外向內(nèi)擠出并凝固堆積，完成下層的截面之后，工作臺下降繼續(xù)打印[6]。

FDM的優(yōu)點如下：材料來源廣泛，如蠟、PLA、PC等能夠熔融塑化的材料均可；不需要激光器，設備結構簡單，成本低廉，后處理過程簡單。作為最早的成型技術，如今在玩具、模型和設計方面得到廣泛的應用。然而，F(xiàn)DM難以生產(chǎn)過大尺寸產(chǎn)品，一般只可以打印中小型物體；生成效率較低，打印時間一般需要幾個小時；由于其工作原理，外部輪廓紋理明顯，影響其美觀；層與層之間靠凝結而成，力學性能也不太理想。

1.5 SLA

SLA以光敏樹脂（多為環(huán)氧化物）、光引發(fā)劑、活性單體和穩(wěn)定劑等為主要組分，在紫外光的照射下逐漸由低聚物變成交聯(lián)高分子聚合物，低粘度的液態(tài)樹脂轉變成為固態(tài)樹脂，打印板向上移動，打印下層的形狀，一層層疊加最終形成零件[7]。

該技術的優(yōu)點是光敏樹脂在分子水平層次發(fā)生化學反應，打印精確度高，尺寸收縮率小，打印出來的產(chǎn)品惟妙惟肖，強度較高?？捎嬎銠C修圖、可聯(lián)機操作，可遠程控制，有利于生產(chǎn)的自動化。其不足是原材料和設備的成本較貴，打印大型器件時需要加入支撐，不然容易塌陷。光敏樹脂的品種有限，如何改良得到更好的光敏樹脂也是該領域的關鍵。

2 Bio-3DP的方式和特點

2.1 Bio-3DP概述

Bio‐3DP基于計算機3D模型，利用生物打印材料如陶瓷基漿料、醫(yī)用高分子材料、水凝膠漿料等，按照仿生學形態(tài)功能和環(huán)境，通過離散堆積的方法，打印出所需的結構復雜、功能齊全的生物醫(yī)用產(chǎn)品。通過制造技術和生命科學的組合，其發(fā)展?jié)摿薮螅梢杂糜谥圃烊梭w組織和臟器。未來，心臟或者其他器官移植的最終極發(fā)展方向將發(fā)生最根本的改變。

細胞的生長需要特定的生物環(huán)境和條件。因此，Bio‐3DP與一般的3DP技術不同，需要在特定的環(huán)境中進行，即在適應細胞生長繁殖的環(huán)境中進行相關細胞、組織的打印與培養(yǎng)。利用Bio‐3DP技術進行細胞和基質培養(yǎng)，既要保證生物活性，又要通過應用該技術實現(xiàn)組織和臟器的個性化制造[8]。

2.2 Bio-3DP的方式及特點

噴墨Bio‐3DP的原理是將帶有導電性的細胞墨水在壓力作用下送入噴頭噴槍，經(jīng)過超聲波或者電能的作用使細胞噴出時每個墨滴帶有指定的動能，連續(xù)不斷形成液串，按3D模型的要求準確落在打印載體表面的特定位置。其關鍵問題是解決細胞的生物活性和墨滴著陸位置[9]。其優(yōu)點是生物活性高，打印速度較可觀。但是，在噴墨過程中，難以控制液滴的方向性和液滴的大??；混合生物細胞的墨水容易受熱、電、其他能量的影響，造成細胞活性降低；因打印材料的粘度要求導致可選擇的材料非常有限。熱電噴墨打印機的工作取決于打印頭的電加熱，使得產(chǎn)生壓力脈沖并使液滴遠離噴嘴。

熱熔生物材料由加熱器熔化，材料首先被引入細絲，然后由送絲機傳送到熱熔噴嘴。熱熔噴嘴處有加熱裝置可以加熱材料。另一方面，根據(jù)軟件設計的分層數(shù)據(jù)控制路徑，將半熱熔狀態(tài)材料擠壓到預定位置并沉積之后，將其凝固形成。細胞在體外培養(yǎng)時不能承受過高的溫度，因此熱熔環(huán)境對細胞是極大的傷害，細胞活性差是影響該技術在臨床方面應用的主要因素[10]。

另一種打印技術是激光輔助生物打?。↙aser Assisted Bioprinting，LAB），使用激光誘導前向移動原理移動細胞，通過激光和聚焦片使焦點聚焦在吸收層（金或鈦）以達到加熱效果，熱量由吸收層傳播到下層的生物墨水層薄膜，薄膜形變產(chǎn)生射流。其中吸收層作用是保護細胞，防止激光直接接觸生物墨水，現(xiàn)如今利用飛秒激光已經(jīng)發(fā)展出超快激光誘導動物細胞水凝膠的方法。LAB可打印從毫米級到納米級形態(tài)特征的生物結構；所有的細胞類型都能打?。粺o噴頭，不存在細胞堵塞問題。細胞存活率在95%以上。但是吸收層容易被污染且造價昂貴，臨床應用受限。

3 Bio-3DP的研究現(xiàn)狀

3.1 Bio-3DP的四個層次

Bio‐3DP的發(fā)展可以分為四個層次。

第1層次不涉及生物培養(yǎng)技術，使用的材料是非降解的生物不相容材料，打印產(chǎn)物大多為非植入目的的仿生模型。如：利用3DP技術制造的個性化手骨支架模型，可以代替石膏板更加靈活方便、打印器官模型（口腔、骨骼），用于放射治療的防輻射器具[11]，模擬手術等。

第2層次使用生物相容、非降解材料進行永久植入物的制造。植入型醫(yī)療器械個性化的定制，利用鈦合金材料打印與患者完美契合。醫(yī)生可以借助3DP技術，按照1∶1的比例完整打印出患者所需的骨骼如：Basgul等[12]利用熔融PEEK長絲的方法3DP出腰椎融合器標準件。徐蒙蒙等[13]通過實驗研究，給出了一種通過3DP來制備組織補片的方法。

第3層次進行人工活性組織支架的研究，可以植入人體并修復植入部位損傷的功能，也可以作為細胞繁殖分化和新陳代謝的場所，也是信號分子和活性因子的載體，可以促進細胞的融合。氣道支架和心臟支架已經(jīng)越來越多的應用在臨床手術中。組織工程支架應用廣泛，幾乎涉及人體所有器官。支架類型包括骨支架、神經(jīng)支架、皮膚支架、其他組織支架等，具有良好的可降解和生物相容性。

第4層次在合適的體外環(huán)境進行細胞和器官的打印與培養(yǎng)[14]。生物材料包括有細胞外基質功能的水凝膠、不同的干細胞和營養(yǎng)物質。先將細胞（或細胞聚集體）和溶膠（水凝膠的前驅體）的混合物在營養(yǎng)物質中進行培養(yǎng)。Bio‐3DP時，將混合液加入打印噴頭，通過3D軟件的編碼，可以精確控制細胞分布在預定打印點。器官打印在細胞打印的基礎上，需要構造更多的細微管道結構，實現(xiàn)血液和營養(yǎng)物質的輸送。

3.2 Bio-3DP的研究現(xiàn)狀

嚴格來講，只有第四個層次的制造過程設計到細胞和組織，是真正意義上Bio‐3DP。前三個層次經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，如今技術已經(jīng)成熟。生物模型的打印如口腔模型，可以幫助醫(yī)生更好地完成手術規(guī)劃，也方便實習生更直觀的掌握醫(yī)學結構。仿生骨骼和關節(jié)、可降解的制品，如活性陶瓷骨、可降解的血管支架、多層復合結構氣道支架[15]、載藥氣管支架[16]等研究也已有很多的報道。

近幾年來，雖然Bio‐3DP已經(jīng)可以成功打印出外形神似的組織和器官，但是組織和器官內(nèi)部血管通道如何打印，如何在體外打印未分化的細胞、培養(yǎng)干細胞等問題仍未解決。如何實現(xiàn)Bio‐3DP的功能化突破和應用，解決形似而神不似的問題是Bio‐3DP的未來發(fā)展突破瓶頸的問題。對細胞打印而言，控形控性所涵蓋的三大基礎科學問題為：生物墨水的可控化、打印結構的活性化、打印結構的功能化。作者認為可以從生物材料（生物墨水）的合成、打印工藝（打印機）的改良到營養(yǎng)輸送通道（血管、神經(jīng)）的構建，以及功能化的誘導等方面攻克系列難題。

生物墨水為細胞提供體外的生存環(huán)境，因此要有非常好的生物活性，要營造與細胞外基質相同的生物環(huán)境，只有這樣才能更好地使細胞在墨水中存活、增殖分化并建立彼此間的通信[17]。目前，最常用的海藻酸鹽系生物墨水成形性能及機械性能較好，但是生物兼容性方面不如膠原類生物墨水；膠原類生物墨水由于其來源于生物體內(nèi)具有良好生物相容性也有應用，但是需要后期改性或混入改性材料。GelMA材料可打印性及可成形性都十分優(yōu)秀，是Bio‐3DP中不可或缺的材料。

明膠、海藻酸鹽、細胞外基質、嵌段共聚物F127、聚乙二醇二丙烯酸酯均為常見Bio‐3DP材料。醫(yī)用高分子水凝膠具有十分優(yōu)秀的生物相容性，呈現(xiàn)三維網(wǎng)狀結構，無毒無刺激，利用1 mm水凝膠管道模型，可以實現(xiàn)由毛細血管到微血管床的培養(yǎng)[18]。王錦陽等[19]發(fā)現(xiàn)可以用負載層纖維細胞和角化細胞的膠原，可作為3DP再生皮膚組織的原料。多孔網(wǎng)狀自增強仿生軟組織補片[20]為軟組織的培養(yǎng)提供了可行的理論依據(jù)。

2019年，王見等[21]開發(fā)了一種基于核磁共振的3DP。3D打印遇上MRI醫(yī)療診斷如虎添翼。MRI能獲得原生三維斷面成像，對軟組織、中樞神經(jīng)等有高分辨率，多序列成像使其數(shù)據(jù)可與3DP完美結合。

另外，有研究者從小鼠中提取胚胎干細胞，并將胚胎干細胞與水凝膠生物材料混合，運用計算機斷層掃描成像技術得到的生物參數(shù)進行生物打印，成功獲得仿生主動脈[22]。以及使用微擠壓打印技術將海藻酸鈉、明膠和PEGTA等生物材料與皮膚干細胞相混合，制備出既符合生物力學要求又具有良好生物相容性的人造血管[23]。

2017年，Hu等[24]使用小鼠體內(nèi)提取的脂肪干細胞和纖維細胞生長因子2（堿性因子）的混合材料，利用光固化打印技術得到仿生神經(jīng)，并將其移植到小鼠的神經(jīng)傷口四周，觀察發(fā)現(xiàn)仿生神經(jīng)有著和小鼠自身相同的修復效果。

同年，Zhang等[25]也報道了多細胞/材料體系的仿生打印技術，可以在體外打印培養(yǎng)構造仿生器官，他們設計的高自動化材料打印機適用于多種不同的“生物墨水”，為體外器官再生等提供有效路徑。及至2019年，研究者基于多噴頭生物3DP系統(tǒng)和溶芯支撐法，運用超低溫打印技術，以膠原為管壁材料，水凝膠F127為溶芯材料構建復合管腔結構，經(jīng)過溶液交聯(lián)及凍干處理后將支架浸泡在1℃的去離子水中以去除溶芯材料，順利獲得了具有較好結構及力學性能的膠原管腔支架結構[26]。

Bio‐3DP材料和機器同樣也是生物打印發(fā)展的關鍵。2015年，瑞典公司以確立Bio‐3DP領域的統(tǒng)一標準為目標，開創(chuàng)了一種通用Bio‐3DP墨水，世界上首例基于納米纖維的水凝膠生物打印油墨套件具有易處理、耐沖擊的特性，在仿生組織模型方面具有良好的應用前景。這款Bio‐3DP油墨在人類的組織模型構建方面具有光明的未來。2017年生物3D打印機的研究也有了里程碑的突破——中國研制出首臺高通量、集成化的打印機。

4 生物3D打印技術的未來展望

Bio‐3DP技術方興未艾，4D打印技術也正備受社會關注，未來將屬于4D打印技術。4D打印技術基于3DP，添加了時間維度。形狀記憶聚合物（Shape Memory Polymers，SMPs)，又稱為形狀記憶高分子，也就是具有初始形狀的物件，通過外部作用力使其形變到特定形狀，當所處狀態(tài)恢復或環(huán)境恢復到原始時，物件可以不受外力的幫助恢復到初始形狀?？梢酝瓿伞皯浧鹗紤B(tài)——固定變形態(tài)——恢復起始態(tài)”的循環(huán)[27]。

未來生物4D打印將在生物醫(yī)療領域大顯身手。應用納米技術可以使生物技術在有限的血管內(nèi)發(fā)揮無限的作用。心臟支架是4D打印應用的一種，微型心臟支架通過血管注入人體，當它達到心臟指定的部位時，給予物理刺激，便可以變形成為心臟支架?？梢詼p少患者的痛苦，不需要開胸手術。麻省理工學院制造出一種微型藥物膠囊，當人體生病發(fā)燒體溫過高時，膠囊形變釋放藥物，第一時間達到治療效果[28]。

李春妍等[29]利用Fe3O4納米顆粒改良PLA，使聚乳酸擁有磁性，打印的形狀記憶納米復合材料支架放置在交變磁場中時，折疊的支架可以在短時間內(nèi)非接觸的進行驅動展。4D支架結構實現(xiàn)了非接觸控制和遠程驅動，在微創(chuàng)血管支架領域具有很大的應用前景。Chon等[30]以甲基丙烯酸酯化的聚己內(nèi)酯為材料，利用SLA技術成功打印出一種遇熱時10 s左右可恢復到原始形狀 的“記憶”氣管支架。也有報道指出可以采用3D印刷技術制造由天然蛋白質和水凝膠材料組成的新型葉狀4D打印結構。

4D印刷SMP的研究雖然取得了階段性的進展，但是到全面應用到臨床手術中仍需繼續(xù)努力。目前，直接4D印刷SMPs都是單向的，如何做到雙向可逆性，需要設計結構和復合印刷，增加了基于SMPs的4D結構印刷的復雜度，對裝置的需求也更高。4D印刷用的SMPs大部分是熱驅動材料，也有部分是磁場驅動材料。從印刷工藝的角度來看，當加熱細胞組織時，生物活性將大大降低。因此生物4D打印技術的特征和缺點也極大地限制了可印刷SMPs的種類和4D印刷品的性能。未來還有很長的路要走。

5 結論

從Bio‐3DP技術從提出到如今已經(jīng)經(jīng)歷了十多年的發(fā)展，可以說是機遇和挑戰(zhàn)并存，特別是將其應用于臨床仍面臨諸多挑戰(zhàn)和難題。許多具有里程碑意義的技術雖已被研究并逐步開始應用，但如何找到合適的細胞、組織和臟器，以及在構成器官中細胞如何更好地相互作用有待持續(xù)深入。此外，需進一步優(yōu)化和改進打印工藝，開發(fā)更優(yōu)的生物材料也是重點。Bio‐3DP的進步將引發(fā)生命科學領域的新革命，特別在組織和器官修復和再造方面發(fā)揮巨大作用，解決器官和組織移植領域的來源這一世界難題。到那時候，人類有望實現(xiàn)人體組織和器官“壞哪里換哪里”的期望。