骨髓染色體制片方法探討

陳 超 周婷婷 王雙閣 路 放 李雨艷

吉林金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司，吉林 長(zhǎng)春 130000

物種的染色體組型在一定程度上具有該物種的特異性，并可在細(xì)胞層面上表現(xiàn)出該物種的進(jìn)化過(guò)程。伴隨對(duì)染色體研究的不斷深入，科學(xué)家期望利用先進(jìn)技術(shù)，使染色體內(nèi)部結(jié)構(gòu)分化染色，以獲得更具有特征鑒別功能的信息。骨髓細(xì)胞染色體實(shí)驗(yàn)室制片方法具體包括秋水仙素處理、收集細(xì)胞、低滲處理、預(yù)固定、離心、再固定、再離心、制作細(xì)胞懸液、滴片、染色干燥、去浮色、鏡檢等步驟[1]。實(shí)驗(yàn)操作較為簡(jiǎn)單，但影響因素較多，如操作不當(dāng)將不能獲得足夠的細(xì)胞中期分裂相。因此，本文對(duì)實(shí)驗(yàn)室骨髓制片方法進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)操作條件嚴(yán)格控制，對(duì)某些易錯(cuò)方法進(jìn)行改善，以期有效提高實(shí)驗(yàn)成功率、提高標(biāo)本中骨髓細(xì)胞中期分裂相。

1 秋水仙素處理

秋水仙素(又名秋水仙堿)，是從百合科植物秋水仙中提取出的一種生物堿，可抑制細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂，使染色體形態(tài)停留在分裂中期。細(xì)胞分裂相的多少、形態(tài)等是進(jìn)行染色體研究的前提，傳統(tǒng)活體秋水仙素處理方法需要提前數(shù)小時(shí)甚至一天對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物注射秋水仙素，但通過(guò)對(duì)制備的標(biāo)本進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)染色體形態(tài)并不理想，難以進(jìn)行染色體的細(xì)致觀察；而另一種傳統(tǒng)制備方法——血細(xì)胞體外培養(yǎng)法雖可獲得良好的染色體形態(tài)，但是需將血液細(xì)胞在體外無(wú)菌條件下培養(yǎng)3～5d，周期長(zhǎng)，要求條件高[2]。兩種方法均有一定局限性，而對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行體外短時(shí)間培養(yǎng)的同時(shí)進(jìn)行秋水仙素處理可簡(jiǎn)化操作步驟和縮短試驗(yàn)周期，且該方法制作的染色體標(biāo)本分裂相多、形態(tài)良好。具體操作：將收集到的骨髓細(xì)胞置于無(wú)菌培養(yǎng)液中，并加入秋水仙素(濃度達(dá)到10μg/mL)搖勻，封口后37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)60min。本方法可快速簡(jiǎn)單的制作出具有較高質(zhì)量的染色體標(biāo)本，且可大幅度減少昂貴試劑秋水仙素的用量。傳統(tǒng)活體注射法，秋水仙素的用量一般是每克動(dòng)物體用量5～20μg，而本制備方法只需25μg左右，從而降低了試驗(yàn)成本。并且此方法對(duì)于剛剛死亡和瀕臨死亡的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的染色體制作同樣具有重要意義。

2 低滲時(shí)間與室溫關(guān)系

自從徐道覺(jué)于1953年提出細(xì)胞體外培養(yǎng)與低滲技術(shù)以來(lái)，檢查染色體方法有了巨大進(jìn)展。低滲可使細(xì)胞外的水通過(guò)細(xì)胞膜的滲透作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，導(dǎo)致細(xì)胞膨脹、體積擴(kuò)大，進(jìn)而使染色體均勻的分散，細(xì)胞膜變薄，保證在滴片時(shí)細(xì)胞膜易碎，制作出良好的染色體標(biāo)本，以供鏡檢。其關(guān)鍵在于把控低滲時(shí)間，過(guò)短將導(dǎo)致細(xì)胞不易破碎；時(shí)間過(guò)長(zhǎng)將導(dǎo)致細(xì)胞在滴片前已破碎。時(shí)間過(guò)短或是過(guò)長(zhǎng)均得不到良好的制片效果。

以往，國(guó)外對(duì)低滲的時(shí)間和溫度要求較為嚴(yán)格，例如在15℃～30℃的情況下，低滲需要20min；在30℃以上需要13～15min。但這個(gè)范圍波動(dòng)較大，制片成功率依舊較低。分析其原因是低滲時(shí)間不足所致，實(shí)驗(yàn)室的溫度并不固定，室溫可影響器材、樣本、試劑的溫度，尤其是在北方，溫差較大，勢(shì)必影響進(jìn)行低滲操作時(shí)的實(shí)際溫度。如在室溫15℃和30℃的情況下進(jìn)行低滲操作，均進(jìn)行20分鐘，前者時(shí)間不足，而后者時(shí)間多長(zhǎng)，均會(huì)嚴(yán)重影響制片質(zhì)量。為了使細(xì)胞在低滲過(guò)程中充分膨脹，在滴片是獲得最佳的染色體分散效果，對(duì)不同室溫條件下最適低滲時(shí)間 進(jìn)行分析，得出低滲時(shí)間與溫度的關(guān)系符合方程y=-0.4344x+33.99[3]。因此在進(jìn)行低滲操作時(shí)應(yīng)以實(shí)驗(yàn)室溫度為基礎(chǔ)，計(jì)算最佳低滲時(shí)間，允許存在誤差±2min。

3 固定液比例與固定次數(shù)

將經(jīng)過(guò)低滲處理的細(xì)胞立即殺死并保持細(xì)胞形態(tài)的操作稱為固定，通過(guò)固定可使染色體分散良好、形態(tài)清晰。實(shí)驗(yàn)室中常用的固定液為冰醋酸∶甲醇=1∶3的溶液。其中冰醋酸具有較強(qiáng)的滲透能力，固定蛋白質(zhì)作用較強(qiáng)，易使染色體膨脹；而甲醇的作用除固定蛋白質(zhì)外，還有收縮染色體的作用，所以必須嚴(yán)格控制二者比例，才可保證染色體形狀維持原形。且甲醇沸點(diǎn)在65℃左右，發(fā)揮較快，而冰醋酸沸點(diǎn)為118℃，發(fā)揮最慢。因此在配置固定液時(shí)應(yīng)嚴(yán)格按照比例進(jìn)行，最好試驗(yàn)前臨時(shí)進(jìn)行配置，這樣才能保證染色體形態(tài)維持正常狀態(tài)。由于骨髓中含有大量的脂肪組織，可導(dǎo)致制片整體昏暗，嚴(yán)重影響制片質(zhì)量和閱片工作的正常進(jìn)行。而反復(fù)進(jìn)行固定2～3次，并更換固定液滴片，可提高制片的透光度，使背景清澈透亮。

4 離心速度與時(shí)間

離心可使細(xì)胞沉積在試管底部，方便進(jìn)行提取。但細(xì)胞經(jīng)過(guò)低滲、固定等處理后，細(xì)胞膜膨脹，比較脆弱，如離心速度過(guò)快或時(shí)間過(guò)長(zhǎng)易導(dǎo)致細(xì)胞破裂，影響制片效果。因此要個(gè)控制離心速度和時(shí)間，一般將離心速度控制在1000轉(zhuǎn)/min，時(shí)間控制在10min，可得到較好的離心效果[4]。但可根據(jù)具體的低滲時(shí)間和固定次數(shù)進(jìn)行調(diào)整，如低滲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，可試單減慢離心速度，既能保證細(xì)胞在離心過(guò)程中不會(huì)破碎，還能保證細(xì)胞完全下沉。既不會(huì)丟失染色體，又能保障獲得良好的分裂相。

5 沖洗過(guò)程

在撥片染色結(jié)束后應(yīng)利用雙蒸水經(jīng)染液洗去。在沖洗過(guò)程中水流以緩慢為佳，禁忌直接沖洗細(xì)胞所在的位置，避免將染色體沖離玻片。

6 制片過(guò)程與環(huán)境的關(guān)系

染色體分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果與環(huán)境有一定關(guān)系，氣溫過(guò)低、過(guò)高，或是陰雨等天氣常常會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)效果產(chǎn)生負(fù)面影響。因此應(yīng)嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，使其溫度、濕度等保持恒定，可利于染色體標(biāo)本的制作。

7 結(jié)束語(yǔ)

染色體的形態(tài)和數(shù)目在同一物種內(nèi)是相對(duì)穩(wěn)定的，通過(guò)對(duì)其進(jìn)行分析，可對(duì)該物種的遺傳指標(biāo)進(jìn)行了解。而優(yōu)良的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本制作是了解染色體的第一步，因此要不斷對(duì)實(shí)驗(yàn)室制片過(guò)程進(jìn)行規(guī)范，以提高制片質(zhì)量，為后期染色體觀察提供便利。