microRNAs影響急性髓系白血病細胞分化的研究進展

王洪濤，陳萬靈,2*

（1.廈門醫(yī)學院臨床醫(yī)學系，福建 廈門 361023；2.廈門醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院，福建 廈門 361021）

microRNAs（miRNAs）是約22個核苷酸的小RNA分子，與靶mRNA的3’-非反式區(qū)（3’-UTR）結合，誘導mRNA降解或抑制翻譯，并在轉錄水平上負調控靶基因的表達[1]，參與細胞分化、增殖、凋亡和遷移等一系列生物學過程，miRNAs的異常調節(jié)已被證實與諸多疾病的發(fā)生發(fā)展有關[2]。目前已知的miRNAs 包括：miR223、miR-29、miR-142-3p、miR-9、miR-181a、miR-150、miR-22、miR-34a、miR-342、miR-128a/b、miR-146、miR-10a/b、miR-451、miR-17-92等。

急性白血病（acute leukemia，AL）是一類造血干祖細胞的惡性克隆性疾病，與白血病細胞自我更新增強、增殖失控、分化障礙、凋亡受阻有關，分為急性髓系白血?。╝cute myelocytic leukemia，AML）和急性淋巴細胞白血病。已發(fā)現(xiàn)多種miRNA與AML細胞分化相關。本文將對影響AML細胞分化的microRNAs進行綜述。

1 miRNA家族

1.1 miR-223 MiR-223在X染色體q12上。在髓系細胞生成過程中miR-223 表達穩(wěn)步增加，抑制miR-223 表達會阻礙粒細胞成熟和白血病的發(fā)生[3-4]。在臍帶血CD34+細胞中敲除或過表達miR-223的實驗結果表明[5]，在體外敲除miR-223延遲了紅系祖細胞分化，而在體內過表達miR-223可增加紅細胞、T 淋巴細胞、早期B 淋巴細胞的生成。上述研究結果提示miR-223在造血干細胞和祖細胞分化、粒細胞生成過程中具有重要作用。

miR-223表達受多個轉錄因子的調控。有研究[4-6]表明，轉錄因子NFI-A和C/EBPα可與miR-223前體啟動子競爭性結合而調節(jié)miR-223的表達水平。NFI-A使miR-223維持在較低水平，而全反式維甲酸（all-trans retinoic acid，ATRA）誘導的C/EBPα 表達則導致miR-223 表達上調，并促進白血病細胞向粒細胞分化。miR-223抑制NFI-A翻譯，產生有利于粒細胞分化的負反饋環(huán)。另外，白血病中的部分融合蛋白可抑制 miR-223 的表達。Fazi 等[7]研究表明，miR-223 在含AML1/ETO（AE）融合蛋白的AML細胞中表達下調，并確定了miR-223是AE融合蛋白的直接靶點，AE可通過募集染色質重構酶而誘導miR-223沉默。AE蛋白水平的下調能上調miR-223 的表達水平，從而促進白血病細胞分化。另外，過表達miR-223 也可使含PML/RARα 融合蛋白的NB4 細胞向粒細胞分化[6]。miR-223 的異常表達可誘導HL60 細胞向粒細胞分化，但該細胞株并無表達融合蛋白[7]。說明融合蛋白不是miR-223調節(jié)造血細胞分化過程中的關鍵蛋白。

Pulikkan 等[8]發(fā)現(xiàn)miR-223 可靶向作用于轉錄因子E2F1，從而抑制髓系祖細胞增殖，并促進細胞分化。另外，Johnnidis 等[9]在小鼠中敲除 miR-223 基因 ，這些 miR-223 缺陷的小鼠粒細胞增多，并處于高炎癥狀態(tài)。研究還發(fā)現(xiàn)，促進髓系祖細胞增殖的轉錄因子MEF2C 是miR-223 的靶基因。缺失MEF2C 基因可抑制miR-223 缺失的小鼠的祖細胞增殖，并減少中性粒細胞數(shù)量。因此，miR-223 可能是祖細胞增殖、粒細胞分化和活化的負調控因子。有研究[6-8]顯示，miR-223 是粒細胞分化的正向調節(jié)因子，這可能因為在髓系細胞發(fā)育的不同階段，miR-223 表達的濃度不同，導致其功能不同[9]。

1.2 miR-29、miR-142-3p 人類miR-29 家族分布于1 號染色體和7號染色體，主要有3個成員，包括miR-29a、miR-29b和miR-29c。人的miR-142 基因定位17 號染色體上。premiR-142 長度為87 個核苷酸，能編碼兩種成熟的miRNA（miR-142-3p和miR-142-5p）。Wang等[10]在白血病細胞株和CD34+造血干/祖細胞的分化過程中檢測到miR-29a 和miR-142-3p表達上調。通過功能獲得和功能喪失的實驗，表明在佛波醇酯（phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）或ATRA誘導下，上述兩種miRNAs能促進HL-60、THP-1或NB4細胞分化，并可直接抑制cyclin T2（CCNT2）基因，誘導單核細胞分化。此外，miR-29a 靶基因細胞周期蛋白依賴性激酶6（CDK6）、miR142-3p 的靶基因 TGF-β 激活激酶 1/MAP3K7結合蛋白 2（TGF-βactivated kinase 1/MAP3K7 binding protein 2）均參與調節(jié)粒細胞和單核細胞分化[10]。

另外 ，在 AML 細胞中 miR-29a 和 miR-142-3p 表達顯著降低，靶基因的蛋白表達水平明顯升高[10]。在正常人與AML 患者的造血干/祖細胞中過表達miR-29a 或miR-142-3p，他們的靶基因表達下調，同時可促進髓系細胞分化[10]。上述發(fā)現(xiàn)證實miR-29a 和miR-142-3p 是正常髓系細胞分化的關鍵調控因子，低表達參與AML的發(fā)生發(fā)展過程。

1.3 miR-9 在PMA誘導THP-1細胞的單核細胞分化模型中，Chen 等[11]發(fā)現(xiàn)miR-9 的表達在細胞分化過程中顯著下調。在t（8；21）的AML 中，過表達miR-9 可抑制人類AML細胞和異種移植小鼠模型的白血病細胞生長，誘導向單核細胞分化，并抑制細胞增殖[12-13]。在體外和體內實驗中，miR-9可通過結合let-7 靶向LIN28B/let-7/HMGA2 軸抑制AML t（8；21）陽性細胞株kasumi-1細胞的生長，誘導KASUMI-1細胞分化[12]。另外，加入miR-9-1 也可誘導SKNO-1 細胞分化并抑制其增殖[13]。另一方面，沉默miR-9-1 可促進靶基因（RUNX1、RUNX1T1 和RUNX1-RUNX1T1）的表達，抑制t（8；21）AML 細胞株的分化和增殖[13]。在EVI1 誘導的AML中，沉默miR-9 表達導致細胞凋亡和髓系細胞生成減少[14]。提示miR-9在AML中發(fā)揮促進造血細胞分化的作用。

1.4 miR-181 miR-181家族包括4個高度保守的成熟miRNA成員，即miR-181a、miR-181b、miR-181c和miR-181d。目前較多報道集中在miR-181a，關于miR-181c 和miR-181d 的研究報道較少。在正常骨髓中，miR-181a主要存在于B淋巴細胞、T 淋巴細胞、單核細胞和粒細胞中[15]。Chen 等[16]研究表明，過表達miR-181 能增加體內外B 淋巴系細胞的比例，表明miR-181 是B 淋巴細胞分化的正調控因子。研究還發(fā)現(xiàn)當B淋巴細胞增多時，髓系細胞和其他類型淋巴細胞的分化并未完全被阻斷，表明miR-181 可能是功能的調節(jié)者。Debernardi 等[17]報道 miR-181a 在 AML FAB M1/M2 患者中的表達水平較M4/M5 高，間接說明miR-181a 與髓系細胞分化相關。此外，在紅系分化過程中miR-181a 和miR-181b 的表達水平升高[18]。

1.5 miR-24 miR-24在不同分化程度的造血細胞中的表達不同。如miR-24 富集于正常人CD34+造血干/祖細胞中[19]。Lal 等[20]報道m(xù)iR-24 在造血細胞分化過程中表達上調。Sharbati等[21]研究表明，在單核系分化過程中miR-24表達上調。miR-24可通過多個靶基因參與造血細胞的增殖、分化、凋亡等過程。如Zaidi 等[22]報道上調miR-24 可抑制MAPK磷酸化而激活下游信號通路，從而促進髓系細胞增殖，阻滯粒系細胞分化。miR-24 可與ALK4 的3’-UTR 結合而下調ALK4 的表達，從而抑制紅系細胞分化、CD34+造血祖細胞成熟[23]。

1.6 miR-22 在 HL-60、THP1 和CD34+造血干/祖細胞向單核/巨噬細胞分化過程中，Shen等[24]檢測到miR-22表達增加，證實單核/巨噬細胞分化過程中關鍵的轉錄因子PU.1，在分化過程中促使miR-22 的激活。通過過表達和沉默實驗，Shen 等[24]證明 miR-22 促進單核/巨噬細胞分化，MECOM（EVI1）mRNA 是 miR-22 的直接作用的靶基因，MECOM（EVI1）在分化過程中起負調節(jié)作用。miR-22介導MECOM降解，提高c-Jun 表達水平，并減少MECOM-和GATA2 介導的干擾作用，最終增加c-Jun 和PU.1 的相互作用，從而促進單核/巨噬細胞的分化。Shen等[24]還觀察到在AML患者中，PU.1和miR-22顯著下調，MECOM顯著上調，miR-22的再導入緩解AML患者的分化障礙，并抑制骨髓原始細胞的生長。提示miR-22 在正常造血和AML 發(fā)展中的新功能和作用機制，并體現(xiàn)其在AML診斷和治療中的潛在價值。

1.7 miR-34a miR-34是一個進化保守的miRNA家族，共3個成員：miR-34a、miR-34b、miR-34c。可檢索到 miR-34a 與AML 細胞分化的報道。Navarro 等[25]報道 miR-34a 在 PMA誘導的巨核細胞分化過程中表達上調，而在氯化高鐵血紅素誘導的紅細胞分化過程中表達并未上調。在K562細胞中過表達miR-34a可抑制細胞增殖，導致細胞周期阻滯在G1期，促進巨核細胞分化。miR-34a在血小板生成素誘導的CD34+造血干細胞的分化過程中表達上調，且過表達miR-34a可顯著增加巨核細胞的數(shù)量。miR-34a 直接調節(jié)MYB 的表達，MYB 可促進巨核細胞分化，并可調節(jié)CDK4 和CDK6 的表達，以抑制 G（1）/S 轉換。然而，miR-34a 靶基因在未加入miR-34a的情況下可誘導巨核細胞分化，并迅速下調。表明miR-34a并不參與最初的下調，但可能在此后的維持抑制作用方面發(fā)揮作用。

1.8 miR-342 De 等[26]確定 miR-342 是 ATRA 在誘導 APL分化過程中上調的一種miRNAs。miR-342是造血關鍵轉錄因子PU.1、干擾素調節(jié)因子（IRF）-1 和IRF-9 的直接轉錄靶點。IRF-1維持miR-342在低水平；PU.1和IRF-9在ATRA介導的細胞分化的啟動子區(qū)域結合，從而上調miR-342 的表達。此外，De 等[26]還發(fā)現(xiàn)在 APL 細胞中過表達 miR-342 可促進ATRA誘導的細胞分化。表明miR-342是ATRA誘導的APL向粒細胞分化的新參與者。

1.9 miR-150 AML細胞株HL60、PL21和THP-1的高通量基因表達譜研究[27]表明，與正常細胞相比，在表達miR-150的細胞中，CEPBA、CEBPE和與髓系分化相關的細胞因子的激活有助于髓系細胞分化。Morris 等[28]研究顯示，miR-150在AML 中低表達，再引入miR-150 表達可誘導髓系細胞分化并抑制AML細胞增殖。表明miR-150可促進髓系細胞分化，而miR-150 的缺失或低表達將導致AML 細胞停滯向髓系細胞分化。

1.10 miR-128 miR-128 包括 miR-128-1 和 miR-128-2，分別定位于人染色體2q21.3和3p22.3上，兩者均可生成相同的miR-128。De 等[29]發(fā)現(xiàn)與正常人CD34+祖細胞相比，Lin28A在AML 患者白血病細胞和AML 細胞株中低表達。在體外將Lin28A 轉染到NPM1 突變的OCI-AML3 細胞株中，Lin28A 可促使細胞周期停滯和髓系細胞分化，并增加EGR2、ZFP36 和 ANXA1 的表達。感染 miR-128 慢病毒的OCI-AML3 可下調Lin28 表達，抑制向巨噬細胞分化。在OCI-AML3 和APL/AML 白血病細胞中沉默miR-128a 可誘導髓系細胞分化，增加 Lin28A、EGR2、ZFP36 和 ANXA1 的表達，逆轉髓系細胞分化阻滯。提示miR-128a/Lin28A軸在AML細胞分化受阻中的作用。

1.11 miR-146 人類miR-146 位于5 號染色體上。Yuan等[30]發(fā)現(xiàn)對苯二酚誘導CD34+細胞（暴露5d）和HL-60 細胞（暴露3 h）分化為髓系細胞和免疫細胞的數(shù)量明顯減少，同時 miR-146a 表達上調 ，TRAF6 和 NF-κB 表達下調。使用miR-146a-5p抑制劑抑制miR-146a的表達，可在一定程度上減輕對苯二酚對髓系細胞分化的抑制作用，TRAF6 蛋白和磷酸化IκBα蛋白的水平也恢復到與對照組相同的水平。表明miR146與AML的細胞分化相關。

1.12 miR-10 miR-10a/b 是miR-10 家族的成員，定位于17號染色體。miR-10a/b 在t（8；21）、t（9；11）、NPM1 突變的AML 患者中顯著升高，尤其是 M1、M2 和 M3 亞型[31]?；颊弋惓８弑磉_miR-10a/b 導致異常造血祖細胞無限增殖，并抑制造血細胞分化成熟。miR-10a過表達與FAB-M3/t（15；17）亞型、NPM1 突變相關，可促使骨髓中的幼稚細胞百分比降低；而 miR-10b 的過表達與 NPM1、DNMT3A 突變相關，則骨髓中的幼稚細胞百分比升高[32]，且單核細胞分化的調節(jié)因子KLF4 與細胞周期的調節(jié)因子RB1CC1 是miR10a 的靶基因[33]。

1.13 miR-451 miR451 是近年新發(fā)現(xiàn)的miRNA，位于17號染色體q11.2。Bruchova-Votavova 等[34]研究結果表明，miR-451參與紅系分化的調節(jié)，并具有促進分化的作用。另外，通過功能喪失和獲得實驗，Song等[35]證明人異質性胞核核糖核蛋白A1（hnRNP A1）在粒細胞分化過程中表達下調，降低對C/EBPα 表達的抑制，增加的C/EBPα 表達可促進細胞分化，miR-451 可通過靶向下調hnRNP A1 而促進粒細胞分化。

1.14 miR-17-92 簇 miR-17-92 簇是報道最多的 miRNA 簇之一。miR-17-92基因簇位于人類基因組染色體13q31.3上，編碼 6 個成熟的 miRNAs，包括 miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1和miR-92a-1。有研究[36]表明，與正常人相比，miR-17-92 在 APL 中表達上調。在 ATRA 誘導 NB4 細胞分化過程中，c-Myc 和miR-17-92 的表達顯著受到抑制。在這一過程中，c-Myc直接調控miR-17-92。過表達miR-17-5p 可阻礙ATRA 誘導的細胞分化。另外，miR-17-92 的異常表達抑制DMSO誘導HL-60細胞向粒細胞分化[37]。

1.15 miR-16 miR-16 由22 個核苷酸組成，定位于13q14。Sueur等[38]研究表明，下調miR-16的表達可部分修復經FLT3抑制劑AC220 處理的細胞的增殖作用，而miR-16 過表達則阻止細胞增殖并引起AML細胞向單核細胞分化。MiR-15a/16-1在經ATRA處理的NB4、HL-60和U937細胞株和原代白血病細胞中表達上調。過表達miR-15a/16-1不能直接促使細胞發(fā)生分化，但可促進ATRA誘導的NB4和U937細胞分化[39]。

1.16 miR-125 miR-125 家族包括 miR-125a、miR-125b-1、miR-125b-2。miR-125a 定位于 19 號染色體 q13，miR-125a-3p 和 miR-125a-5p 為 miR-125a 的兩條成熟的 miRNA。而miR-125b-l 和 miR-125b-2 分別定位于 11 號染色體 q23 上和2l號染色體q21上。Dakir等[37]研究表明過表達miR-125a-5p可促進HL-60/NB4 細胞及CD34+造血干/祖細胞向粒細胞分化。Bousquet 等[40]報道，體外轉染miR-125b 可阻止CD34+細胞分化，也可阻斷經化學處理的HL60 和NB4 向單核細胞分化。因此，miR-125b 上調可能導致體內白血病細胞分化阻滯。

1.17 miR-126 miR-126 位于人類9 號染色體q34.3。Li等[41]研究表明，過表達miR-126可激活在LSCs/LICs和/或原始HSPCs中高表達的基因，而敲除miR-126則激活在分化較為成熟的造血細胞中高表達的基因。因此，miR-126過表達可能主要作用于原始HSPCs，而miR-126敲除可能主要作用于分化程度較高的祖細胞。

1.18 其他miRNAs 除上述外，還有其他的miRNA 與AML細胞分化相關。如Riccioni等[42]分析miR-21及其靶基因PDCD4（Programmed Cell Death 4，程序性細胞死亡4）在正常造血分化和AML 中的表達。結果表明，在正常的粒細胞/單核細胞分化過程中，miR-21 表達明顯上調，與此同時PDCD4 蛋白水平下調。Popovic 等[43]研究表明，在正常骨髓造血祖細胞中過表達miR-196b可促進細胞增殖和提高細胞存活能力，并阻滯部分髓系細胞分化。對CD34+人造血干細胞的獲得性和缺失性實驗證實，miR-130a 通過干擾關鍵轉錄因子的表達抑制單核細胞分化[44]。在體內miR-20a 抑制HIF-1a誘導的U937細胞分化，促進U937細胞增殖[45]。

2 小結

研究發(fā)現(xiàn)，越來越多的miRNA 通過影響造血細胞分化而參與AML發(fā)生發(fā)展過程，有的阻滯造血細胞分化，有的促進造血細胞分化，可作用于不同時期的造血細胞、不同系別的造血細胞。另外，miRNA不僅影響造血細胞分化，也可影響細胞增殖、凋亡等生物學過程，其中影響造血細胞分化的miRNA有望作為治療AML的新靶點。