雙泵雙氧合機械灌注設(shè)備應(yīng)用于熱缺血損傷豬肝臟低溫灌注的可行性研究

何錫然，譚曉宇，張 琳，劉華敏，鄺偉鍵，梁銘炬，周偉津，郭家钘，陳素平，霍 楓*

（1.廣東順德工業(yè)設(shè)計研究院（廣東順德創(chuàng)新設(shè)計研究院）生物醫(yī)學(xué)部，廣東佛山 528311；2.南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院肝膽外科，廣州 510010；3.廣東丁沃生醫(yī)療器械有限公司研發(fā)部，廣東佛山 528311）

0 引言

對于終末期肝臟疾病患者，肝移植已成為唯一有效的治療手段[1]。目前全球已有200 余個肝移植中心，迄今已完成累積超過10 萬余例肝移植手術(shù)，并且每年以8 000～10 000 例次的速度遞增[2]。臨床肝移植的快速發(fā)展使供肝短缺的情況日趨嚴(yán)重。目前，供肝短缺的情況迫使臨床醫(yī)生更多地使用缺血損傷肝臟等邊緣供肝。但是來源于邊緣供體的器官可能引起更高的移植物早期功能障礙、原發(fā)性無功和肝內(nèi)膽管并發(fā)癥等的發(fā)生率[3-4]，從而影響患者的長期生存率。同時，邊緣供體的器官對冷保存相關(guān)的缺血損傷更加敏感[5]。因此，在器官供應(yīng)短缺的情況下，這種高危供體器官的使用仍然有限。鑒于此，肝移植領(lǐng)域需要一種新的器官保存技術(shù)。低溫機械灌注（hypothermic machine perfusion，HMP）在4 ℃下提供持續(xù)的循環(huán)灌注，可以提供代謝底物和去除代謝廢物。研究表明，HMP 結(jié)合供氧能夠恢復(fù)細(xì)胞的能量水平，減緩再灌注損傷時的線粒體損傷和活性氧釋放[4]。目前，已進入臨床應(yīng)用階段的肝臟HMP 設(shè)備有荷蘭Organ Assist公司的Liver Assist[6-7]和美國Organ Recovery Systems公司[8-9]的LifePort Liver Transporter。對于攜氧低溫灌注，目前產(chǎn)品化比較成功的設(shè)備是Liver Assist，該設(shè)備的肝動脈和門靜脈均采用壓力控制模式。但是該設(shè)備運輸受限，供肝獲取后需要經(jīng)靜態(tài)冷保存運輸至移植中心后才能連接設(shè)備進行灌注，因此為了避免冷缺血時間過長，使用Liver Assist 的灌注時間需要控制在1～2 h。但是靜態(tài)冷保存結(jié)合短時間低溫灌注的模式不適合幅員遼闊的中國國情，因此本項目組構(gòu)建了一臺離體肝臟雙泵雙氧合機械灌注設(shè)備DEVOCEAN-LIVER 2000，是兼具常溫機械灌注與HMP 的離體機械灌注設(shè)備。本設(shè)備對門靜脈的控制采用恒流模式，且設(shè)備將計劃應(yīng)用于救護車，故未來的應(yīng)用模式為器官獲取組織在臨床上獲取供肝后，首先進行修肝，然后連接設(shè)備，隨后放置于救護車上，轉(zhuǎn)運至移植中心。這種模式能夠縮短靜態(tài)冷保存的時間，延長攜氧低溫灌注的時間，更好地改善肝細(xì)胞的缺氧情況，減輕移植后的再灌注損傷。本實驗研究為設(shè)備研發(fā)的初始階段，目的是驗證設(shè)備的穩(wěn)定性和較長時間攜氧低溫灌注的可行性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料

實驗動物：健康巴馬小型豬3 只，雌性，體質(zhì)量45～50 kg，由南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院實驗動物中心提供。所有實驗豬在實驗前禁食12 h，禁止飲水6 h。實驗操作過程均符合動物中心的倫理要求。

灌注設(shè)備：離體肝臟雙泵雙氧合機械灌注設(shè)備DEVOCEAN-LIVER 2000，由廣東順德工業(yè)設(shè)計研究院（廣東順德創(chuàng)新設(shè)計研究院）、南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院、廣東丁沃生醫(yī)療器械有限公司聯(lián)合研發(fā)，可以對離體肝臟進行肝動脈和門靜脈雙重氧合灌注。該灌注設(shè)備主要包括：2 個離心泵（Revolution，索林集團意大利有限公司）、2 個氧合器（EU5032 Trilly 嬰兒型，意大利Eurosets）、1 個溫度傳感器、2 個壓力傳感器、2 個流量傳感器、2 個血栓過濾器、1 個溫控水箱，以及自制的儲肝器、灌注管路、膽管插管等，通過管路連接形成肝動脈循環(huán)和門靜脈循環(huán)。其原理圖如圖1 所示。

圖1 離體肝臟雙泵雙氧合機械灌注設(shè)備原理圖

實驗儀器與試劑：呼吸機（S1100 型，南京舒普思達醫(yī)療設(shè)備有限公司）、多參數(shù)監(jiān)護儀（M-9000S，深圳市艾瑞康醫(yī)療設(shè)備有限公司）、全自動雪花制冰機（IMS-70，常熟市圣海電器有限公司）、全自動生化分析儀（Pointcare M3，天津微納芯科技有限公司）、血氣分析儀（i-STAT300，Abbott Point of Care Inc）、電子稱（HY-809B，至尊）、一次性醫(yī)用靜脈留置針（24G，江西豐臨醫(yī)用器械有限公司），導(dǎo)尿管（16Fr雙腔，湛江事達實業(yè)有限公司）、硫酸阿托品注射液（天津金耀藥業(yè)有限公司）、舒泰50（法國維克有限公司）、丙泊酚乳狀注射液（西安力邦制藥有限公司）、氯化鉀注射液（湖北科倫藥業(yè)有限公司）、高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液（上海輸血技術(shù)有限公司）、UW 機械灌注液（美國Bridge to Life 公司）、肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫(yī)藥集團有限責(zé)任公司）、注射用頭孢西丁鈉[國藥集團致君（深圳）制藥有限公司]、豬IL-6 ELISA 試劑盒（ELP-IL6，RayBio）、豬TNF-α ELISA試劑盒（ELP-TNF-α，RayBio）以及組織固定液（江蘇世泰實驗器材有限公司）。

1.2 實驗分組

本實驗為單臂設(shè)計，所有實驗動物的肝臟均采用離體HMP，用于驗證離體肝臟雙泵雙氧合機械灌注設(shè)備DEVOCEAN-LIVER 2000 的可操作性及穩(wěn)定性。

1.3 豬肝臟的獲取

耳后肌內(nèi)先注射硫酸阿托品注射液0.05 mg/kg，15 min 后注射舒泰50 溶液2～3.5 mg/kg 進行基礎(chǔ)麻醉?；A(chǔ)麻醉后，豬耳緣靜脈留置套管針，建立靜脈輸液通道，利用微量注射泵每小時泵入丙泊酚乳狀注射液2～5 mg/kg 維持麻醉。進行氣管插管，利用呼吸機輔助呼吸。腹部正中線切口進腹，切口上抵胸骨劍突，下達恥骨聯(lián)合，游離腹主動脈、下腔靜脈及門靜脈。耳緣靜脈注射1 g 氯化鉀注射液，使心臟驟停。靜置實驗豬60 min，建立熱缺血60 min 模型。60 min 后，結(jié)扎胸主動脈，向腹主動脈置入已剪開口的16Fr 導(dǎo)尿管進行在體冷灌注，灌注液為4 ℃的高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液，體積為1 L；同時進行門靜脈插管，剪開肝靜脈出口進行在體冷灌注，灌注液為4 ℃的高滲枸櫞酸鹽嘌呤溶液，體積為1 L?？焖偃∠赂闻K，將其置入裝有4 ℃生理鹽水的容器。修整肝門區(qū)域多余組織，剔除肝門區(qū)域的淋巴結(jié)，進行肝動脈和膽道插管，隨后記錄肝臟質(zhì)量。

1.4 HMP

開始灌注之前，灌注管路內(nèi)用1.5 L UW機械灌注液進行預(yù)充，排除管路中的氣泡。隨后加入6 250 U 肝素鈉注射液和1 g 注射用頭孢西丁鈉，開始接通氧氣瓶。肝臟連接設(shè)備，灌注溫度為4 ℃，氧氣體積分?jǐn)?shù)為100%。肝動脈采用壓力控制模式，設(shè)定為25 mmHg（1 mmHg=133.32 Pa）；門靜脈采用流量控制模式，設(shè)定為0.5 mL/[min·g（肝重）]。在灌注過程中，持續(xù)監(jiān)測肝動脈流量及門靜脈壓力，灌注時間為8 h。

1.5 監(jiān)測項目

在灌注過程中，觀察設(shè)備的穩(wěn)定性，記錄灌注流量與灌注壓力。同時每2 h 取灌注液行血氣分析，觀察pH 值、血糖（Glu）和乳酸（Lac）水平。另外，在灌注的第0、2、4、6、8 h 分別從肝上隨機選取2 份樣品，一份組織樣本進行白介素6（IL-6）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平的檢測，另一份進行組織學(xué)檢查，用福爾馬林固定后進行蘇木精-伊紅染色（HE 染色）。根據(jù)鈴木評分[10]以及其他文獻結(jié)果[11-13]，從空泡化、壞死、水腫以及肝竇擴張方面進行評分，每個方面分為無、輕度、中度和重度，分別評分0、1、2、3 分；每張切片隨機選取3 個視野進行雙人評分，最后統(tǒng)計每項得分。

1.6 統(tǒng)計分析

采用IBM SPSS Statistics 23.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行實驗數(shù)據(jù)分析。所有計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，所有計數(shù)資料以百分?jǐn)?shù)表示。

2 結(jié)果

2.1 肝臟灌注前的情況

灌注前肝臟平均質(zhì)量為（888.00±41.33）g，獲取肝臟后需要（69.33±3.38）min 進行修肝。

2.2 灌注參數(shù)

灌注過程中，設(shè)備沒有出現(xiàn)故障。肝動脈的壓力穩(wěn)定維持在24.09～24.65 mmHg，肝動脈流量則從灌注初期的0.04 mL/[min·g（肝重）]逐漸升高至0.09 mL/[min·g（肝重）]。門靜脈的流量穩(wěn)定維持在0.47～0.50 mL/[min·g（肝重）]，灌注初期平均門靜脈壓力為2.79 mmHg，灌注最后1 h 平均門靜脈壓力為1.84 mmHg，呈下降趨勢，結(jié)果如圖2 所示。

圖2 攜氧HMP 的灌注參數(shù)

2.3 灌注液的血氣結(jié)果

從灌注初期至灌注結(jié)束，灌注液的pH 值維持在7.16～7.19；對于Lac 水平，灌注初期為（0.63±0.21）mmol/L，隨后穩(wěn)定在1.31 mmol/L 左右；Glu 水平則在7.83～9.13 mmol/L。灌注液的血氣結(jié)果如圖3所示。

2.4 肝組織IL-6 以及TNF-α 的變化

灌注初期肝組織的IL-6 的平均值為665.97pg/mL，灌注結(jié)束時平均值為606.91 pg/mL。對于TNF-α 水平，灌注初期平均值為0.038 ng/mL，灌注結(jié)束時平均值為0.050 ng/mL，結(jié)果如圖4 所示。

圖3 灌注液的血氣結(jié)果

圖4 肝組織的IL-6 以及TNF-α 水平

2.5 肝組織的病理學(xué)及外觀評價

肝組織的空泡化評分呈下降趨勢，從灌注初期的（2.44±0.40）分下降至灌注結(jié)束時的（1.00±0.33）分。而肝組織的壞死評分則在灌注結(jié)束時輕度升高，灌注初期為（1.22±0.15）分，灌注結(jié)束時為（1.58±0.42）分。肝細(xì)胞水腫評分在灌注前后變化輕微，灌注初期為（1.38±0.29）分，灌注結(jié)束時為（1.33±0.67）分。對于肝竇擴張評分，灌注結(jié)束時為（1.66±0.33）分，比灌注初期（[1.50±0.25）分]輕度升高。肝組織的病理學(xué)評價結(jié)果如圖5 所示，灌注過程的肝臟外觀如圖6 所示。

3 討論

圖5 肝組織的病理學(xué)評價

圖6 灌注過程的肝臟外觀

隨著我國公民器官捐獻工作的開展和器官需求的不斷增加，我國的器官移植技術(shù)需要向高質(zhì)量發(fā)展，使更多等待移植的患者受惠，因此各地的器官獲取中心需要比傳統(tǒng)靜態(tài)冷保存更先進的技術(shù)用于器官保存。HMP 是目前興起的器官保存技術(shù)之一。相關(guān)研究的臨床試驗的結(jié)果表明，HMP 能夠恢復(fù)肝細(xì)胞的三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）水平，減輕移植再灌注損傷，降低移植物早期功能障礙發(fā)生率，同時使膽管并發(fā)癥發(fā)生率下降，縮短住院時間和提高移植物存活率[6-9，14-15]，這均提示其具有良好的應(yīng)用前景。目前，國外已有關(guān)于HMP 技術(shù)應(yīng)用于臨床肝移植的報道，如Liver Assist[6-7]和LifePort Liver Transporter[8-9]的應(yīng)用。本研究中的HMP 設(shè)備為國內(nèi)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的DEVOCEAN-LIVER 2000，具有產(chǎn)品化的設(shè)計，并配備完整的耗材，未來可應(yīng)用于臨床，其與LifePort Liver Transporter、Liver Assist 的比較詳見表1。

本研究的結(jié)果表明，在肝動脈恒壓控制模式和門靜脈恒流控制模式下，本設(shè)備能夠在8 h 內(nèi)穩(wěn)定維持壓力和流量水平，說明設(shè)備運轉(zhuǎn)的穩(wěn)定性良好。同時，肝動脈的流量呈現(xiàn)上升趨勢，而門靜脈壓力表現(xiàn)出下降趨勢，說明肝組織在灌注過程中的阻力在降低。Zeng 等[18]使用LifePort Liver Transporter 對無缺血損傷大鼠肝臟進行門靜脈HMP，灌注流量為0.5 mL/[min·g（肝重）]，數(shù)據(jù)表明灌注3 h 內(nèi)能夠顯著降低阻力指數(shù)，隨后穩(wěn)定3 h 灌注阻力穩(wěn)定。李弦等[19]使用LifePort Liver Transporter 探究HMP 對不同熱缺血時間下心臟死亡大鼠供肝的灌注效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HMP能夠降低熱缺血30 min 肝臟的阻力指數(shù)，但是未能降低熱缺血45 min 肝臟的阻力指數(shù)。本研究使用的DEVOCEAN-LIVER 2000 能夠使熱缺血60 min 肝臟的灌注阻力下降，提示HMP 有助于改善熱缺血損傷嚴(yán)重的肝臟的內(nèi)部通暢程度，有利于移植后肝細(xì)胞獲得充分的血液灌注，表明本設(shè)備的性能比Life Port Liver Transporter 更優(yōu)良。同時，灌注過程中的pH 值、Lac 水平和Glu 水平基本穩(wěn)定。研究表明，熱缺血損傷會導(dǎo)致Lac 和Glu 水平升高[20]，故灌注初期的Lac和Glu 水平較高。由于肝臟處于低代謝狀態(tài)，其代謝Lac 和Glu 的能力下降，所以Lac 和Glu 水平維持穩(wěn)定證明設(shè)備能夠使肝臟穩(wěn)定處于低代謝水平。

表1 LifePort Liver Transporter、Liver Assist 與DEVOCEAN-LIVER 2000 的比較

器官經(jīng)歷缺血后，盡管缺血細(xì)胞需要氧氣生存，但是如果進行常溫復(fù)流灌注常會導(dǎo)致再灌注損傷[21-22]。復(fù)流引起的損傷主要由線粒體來源的活性氧造成[23-24]。線粒體活性氧會導(dǎo)致危險相關(guān)分子模式的釋放，活化庫普弗細(xì)胞，最后激活炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致器官損傷[25-26]。曾承[27]利用大鼠的肝臟進行HMP 和冷保存的對比研究，HMP 較冷保存組可以更為有效地為細(xì)胞供氧，增加ATP 合成，提高超氧化物歧化酶活性，抑制核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB-p65 相關(guān)炎性反應(yīng)通路的活性，從而減輕心臟死亡肝臟的缺血再灌注損傷。另一項研究結(jié)果提示攜氧HMP 能夠抑制炎癥小體信號通路，降低IL-1β 和IL-18 的表達，同時控制TNF-α 和IL-6 的分泌，從而減輕肝臟的缺血再灌注損傷[28]。本研究中肝組織的IL-6 和TNF-α 水平穩(wěn)定，未見升高，提示本設(shè)備的攜氧HMP 有助于抑制炎癥反應(yīng)。其他機制研究表明，氧合HMP 可以維持組織的ATP 水平[7，25，28-29]和抑制脂質(zhì)過氧化[30]。另外，HMP 具有促進肝細(xì)胞再生的潛能，研究表明，HMP 能夠提高細(xì)胞增殖抗原Ki67、增生細(xì)胞核抗原以及細(xì)胞周期基因的表達[31]。而在本研究中，病理學(xué)評價表明低溫氧合灌注能夠防止肝細(xì)胞壞死惡化，項目組將在后續(xù)的實驗中探究低溫氧合灌注對肝細(xì)胞再生的影響。器官在離開供體后會遭受缺血和缺氧，研究表明，空泡化可反映肝組織缺血和缺氧損傷的程度[32-33]。Lee 等[34]發(fā)現(xiàn)攜氧HMP 能夠抑制熱缺血30 min 肝臟的空泡形成，維持肝小葉結(jié)構(gòu)正常。有研究使用LifePort Liver Transporter 對無缺血損傷大鼠肝臟進行門靜脈的HMP，灌注流量為0.5 mL/[min·g（肝重）]，組織學(xué)評價表明灌注明顯擴張了肝竇，且由于LifePort liver Transporter 設(shè)備屬于非攜氧灌注，肝組織的空泡化水平未出現(xiàn)改善[18]。但在另一項研究中，與靜態(tài)冷保存相比，非攜氧HMP 亦能夠降低肝細(xì)胞的空泡化水平，同時改善肝竇淤血情況[31]。本研究的結(jié)果提示低溫氧合灌注可降低肝組織的空泡化水平。未來需要更多的實驗來探討HMP 對肝組織病理學(xué)改變的影響。

綜上所述，離體肝臟雙泵雙氧合機械灌注設(shè)備DEVOCEAN-LIVER 2000 在離體豬肝模型中獲得了比較穩(wěn)定的結(jié)果，說明了設(shè)備的安全性和穩(wěn)定性，不僅能維持肝臟的低代謝狀態(tài)，還能降低灌注阻力和改善肝細(xì)胞缺氧。未來項目組將設(shè)計灌注后肝移植實驗或者模擬復(fù)流實驗，并以靜態(tài)冷保存為對照組，進一步評價HMP 系統(tǒng)的安全性和有效性，為其日后的臨床應(yīng)用提供理論支持。