新型冠狀病毒刺突糖蛋白D614G變異的時(shí)間變化和空間分布特征分析

鄧浩輝 李水鳳 樓燕 余衛(wèi)華 胡肖兵

廣州市第八人民醫(yī)院門診部 510060

新型冠狀病毒D614G 變異是刺突糖蛋白（S 蛋白）最常見的變異之一。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)生該變異的毒株可顯著增強(qiáng)病毒感染能力和傳播能力，并增加患者的致死率。目前包含該變異的新型冠狀病毒毒株時(shí)間變化和空間分布特征國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究納入截止至2020 年7 月21 日在國內(nèi)外新型冠狀病毒公共數(shù)據(jù)庫發(fā)表的序列，其中包括美國國家生物信息中心（NCBI）GenBank數(shù)據(jù)庫11 583條，全球共享禽流感數(shù)據(jù)倡議組織（GISIAD）EpiCoV數(shù)據(jù)庫69 226條，國家基因庫生命大數(shù)據(jù)平臺(tái)（CNGBdb）75條，國家基因組科學(xué)數(shù)據(jù)中心（Genome Warehouse）37 條，國家微生物科學(xué)數(shù)據(jù)中心（NMDC）數(shù)據(jù)庫289條。

1.2 去除各數(shù)據(jù)庫重復(fù)的核酸序列 本研究納入5個(gè)新型冠狀病毒核酸數(shù)據(jù)庫的序列數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，因部分?jǐn)?shù)據(jù)庫存在提交序列重復(fù)的情況，故根據(jù)各序列的信息使用腳本代碼對各序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行去重，去重后共納入69 510條新型冠狀病毒核酸序列進(jìn)行下游分析。

1.3 序列比對與序列數(shù)據(jù)過濾 對去重后的序列使用Minimap 2 v2.17軟件與新型冠狀病毒參考序列（NC_045512）編碼S蛋白的基因片段進(jìn)行序列比對，剔除不包含S 基因的序列。比對后的序列進(jìn)一步過濾，過濾的標(biāo)準(zhǔn)如下：⑴保留從人類身上獲取的病毒序列，剔除宿主為靈長類動(dòng)物和細(xì)胞系等來源的核酸序列；⑵剔除采樣時(shí)間信息欠清晰的序列；⑶剔除比對上新型冠狀病毒參考序列S 基因型，但無包含D614G 讀碼框的短序列；⑷剔除包含S 蛋白D614G 讀碼框前后3個(gè)堿基測序質(zhì)量差的序列，如存在N堿基或簡并堿基的序列。

1.4 新型冠狀病毒S 蛋白D614G 變異分析 使用Geneious R11.1.5 軟件對過濾后的新型冠狀病毒進(jìn)行序列比對，并對S 基因讀碼框進(jìn)行翻譯，確定所有納入分析序列S蛋白D614G變異情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)和百分比表示，使用SPSS13.0軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均取雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 數(shù)據(jù)過濾后保留的核酸序列 本研究經(jīng)數(shù)據(jù)過濾后最終納入分析的序列56 201 條，其中包括NCBI GenBank 數(shù)據(jù)庫 8 111 條，GISIAD EpiCoV 數(shù)據(jù)庫 47 747 條，CNGBdb 數(shù) 據(jù) 庫 69 條 ，Genome Warehouse 數(shù) 據(jù) 庫 26 條 ，NMDC 數(shù)據(jù)庫248 條。其中來自中國的序列1 060 條（1.9%），其他國家來源的序列55 141條（98.1%）。

2.2 D614G變異納入分析核酸序列中存在情況分析 在本研究納入的56 201條新型冠狀病毒核酸序列中，13 570 條（24.1%）序列為野生型，42 631 條（75.9%）序列為D614G 變異型。攜帶D614G 變異的毒株最早在四川（EpiCoV 數(shù)據(jù)庫 ：EPI_ISL_451345） 和 浙 江 （NMDC 數(shù) 據(jù) 庫 ：NMDC60013101-01）2020 年 1 月 24 日采集的樣本中被發(fā)現(xiàn)，該2株毒株均與來自武漢參考序列的毒株（2019年12月30 日，Genbank 數(shù)據(jù)庫：NC_045512）序列同源性最高，同源性均為99.9%以上。

2.3 D614G 變異在不同時(shí)間分布特征分析 在納入分析不同時(shí)間點(diǎn)的核酸序列中，發(fā)現(xiàn)攜帶D614G 變異毒株的比例呈明顯上升趨勢。D614 野生型與D614G 變異型的毒株總數(shù)和各自構(gòu)成比如下：2019 年 12 月（21 條，100.0%比 0.0%），2020 年 1 月（452 條，96.9% 比 3.1%），2020 年 2 月（955 條，82.2%比 17.8%），2020 年3 月（24 270 條，34.2%比65.8%），2020 年 4 月（22 085 條，15.3% 比 84.7%），2020 年5 月（6 699 條，8.9% 比 91.1%），2020 年 6 月（1 719 條，3.1%比 96.9%）。自 2020 年 2 月份起至 2020 年 6 月份，D614G 構(gòu)成比明顯高于2019 年12 月份的數(shù)據(jù)，均P＜0.05，如圖1所示。

圖1 不同時(shí)間點(diǎn)攜帶D614G變異毒株分布情況

2.4 D614G 變異在不同國家分布特征分析 截止至2020 年7 月21 日，在現(xiàn)有新型冠狀病毒公共核酸數(shù)據(jù)庫納入分析的序列中，公布序列數(shù)量前10 的國家和該國公布序列包含D614G 變異毒株數(shù)量和構(gòu)成比如表1 所示。其中D614G 變異構(gòu)成比最多的國家為比利時(shí)（86.7%），其次為英國（79.0%）和美國（76.1%），構(gòu)成比最少的國家為中國（20.2%）。

2.5 D614G 變異在國內(nèi)分布特征分析 在本研究納入分析的1 060 條來自中國的序列中，不同時(shí)間點(diǎn)D614 野生型（846 條，79.8%）和D614G 變異型（214 條，20.2%）的毒株總數(shù)和各自構(gòu)成比如下：2019 年12 月（21 條，100.0%比0.0%），2020 年 1 月（336 條，98.8% 比 1.2%），2020 年 2 月（313 條，98.4% 比 1.6%），2020 年 3 月（316 條，56.0% 比44.0%），2020 年 4 月（72 條，11.1% 比 88.9%），2020 年 5 月（0 條），2020 年 6 月（2 條，0.0% 比100.0%）。自 2020 年3 月份起至 2020 年 6 月份，D614G 構(gòu)成比明顯高于 2019 年 12 月份的數(shù)據(jù)，均P＜0.05。包含D614G的毒株主要分布在廣州（50.9%）、臺(tái)灣（27.1%）和北京（10.8%），如圖2A、2B所示。

表1 截止至2020年7月21日納入分析的序列以及主要國家D614G變異毒株的構(gòu)成比

3 討 論

自2019 年12 月武漢地區(qū)發(fā)現(xiàn)首例新型冠狀病毒肺炎患者起，截止至2020年7月26日，全球213個(gè)國家或地區(qū)均有新型冠狀病毒感染的報(bào)道；據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前感染新型冠狀病毒的人數(shù)為 16 196 503，死亡人數(shù)為 648 327［1-2］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，該病毒的傳染指數(shù)（RO）為2～4，提示在人與人之間有高度的傳染性，并可導(dǎo)致較高的病死率［3-4］。因此，新型冠狀病毒感染是目前嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。

病毒為了適應(yīng)環(huán)境和宿主免疫等因素常導(dǎo)致基因組發(fā)生變異，RNA病毒由于復(fù)制時(shí)保真度較差，更容易在病毒基因組出現(xiàn)變異。病毒大部分變異為無義突變，但小部分變異可致基因組的讀碼框發(fā)生改變，從而影響病毒感染能力和致病性等特征［5-6］。新冠病毒S蛋白以三聚體形態(tài)存在于病毒衣殼表面，其受體為宿主細(xì)胞的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶-2［7-8］。614位點(diǎn)變異是S蛋白主要變異位點(diǎn)之一，D614G變異為野生型的天冬氨酸（D）變異為突變型的甘氨酸（G）［9］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，D614G 變異后的毒株可增強(qiáng)病毒對宿主的感染能力和增加病毒在人群中的傳播能力［10-12］，并可增加新型冠狀病毒感染者的病死率［13-14］。因此，了解包含新型冠狀病毒S 蛋白D614G 變異毒株的時(shí)空分布和流行病毒學(xué)特征有重要的意義。

圖2 D614G變異在國內(nèi)分布特征；A：國內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)D614G變異毒株分布特點(diǎn)；B：D614G變異毒株在國內(nèi)分布情況

本研究中，筆者納入了國內(nèi)外新型冠狀病毒序列數(shù)據(jù)庫的56 201 條核酸序列進(jìn)行分析，結(jié)果提示目前數(shù)據(jù)庫包含D614G 變異的毒株為75.9%，最早出現(xiàn)在中國四川和杭州等地，其與武漢最早發(fā)布的序列同源性最高，提示包含該變異的毒株可能直接起源于武漢。進(jìn)一步對該變異毒株進(jìn)行分析，提示目前攜帶D618G變異毒株主要分布在國外，構(gòu)成比最高的國家為比利時(shí)，其次為英國和美國。筆者對不同時(shí)間的新型冠狀病毒序列進(jìn)行分析，結(jié)果提示攜帶D614G 變異毒株的構(gòu)成比呈明顯上升趨勢；對國內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的序列分析的結(jié)果也提示，攜帶D614G 毒株在2020 年3月份后呈明顯上升趨勢，且國內(nèi)主要分布在廣州和北京等地區(qū)，結(jié)合本院和廣州地區(qū)的實(shí)際情況，在公共數(shù)據(jù)庫中攜帶該變異的毒株構(gòu)成比上升可能與本地區(qū)輸入性病例增加有密切關(guān)系。

綜上所述，筆者對國內(nèi)外公共數(shù)據(jù)庫新型冠狀病毒序列進(jìn)行分析，闡述了攜帶S 蛋白D614G 變異的新型冠狀病毒毒株時(shí)間和空間分布特征。因病毒變異可能隨時(shí)間和空間而變化，應(yīng)繼續(xù)對該毒株進(jìn)行研究，進(jìn)一步了解其流行病學(xué)特征和變化規(guī)律。本研究僅對公共數(shù)據(jù)庫核酸序列進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，其結(jié)果可能不一定完全代表真實(shí)情況，下一步應(yīng)采集臨床樣本進(jìn)行病毒變異檢測，進(jìn)一步對其變異株進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)本研究的結(jié)果，攜帶D614G 變異的毒株目前呈上升趨勢，在新型冠狀病毒疫情常態(tài)化管理階段，應(yīng)繼續(xù)按疫情防控的要求對輸入性病例進(jìn)行嚴(yán)格管理［15-16］，警惕和嚴(yán)防輸入性病例在國內(nèi)傳播的風(fēng)險(xiǎn)。