免疫膠體金技術(shù)在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展

高越 肖立嬌 天津市北辰醫(yī)院檢驗(yàn)科 （天津 300457）

內(nèi)容提要：醫(yī)療用免疫膠體金技術(shù)是利用醫(yī)用膠體金作為標(biāo)記，以硝酸纖維素為固相載體，利用濾膜所具有的微孔過濾能力，使被標(biāo)記的抗體或抗原在濾膜上與特定的配體結(jié)合，從而在毛細(xì)血管的作用下，獲得顏色陽性信號(hào)，從而能在抗體或抗原的定量或定性檢測(cè)中起到重要的作用。對(duì)人體進(jìn)行檢測(cè)的一種新方法，以其快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感、無需專用儀器及試劑、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)，在人類醫(yī)學(xué)的臨床檢驗(yàn)及其它領(lǐng)域中得到了廣泛的應(yīng)用，近幾年來，隨著免疫膠體金技術(shù)的發(fā)展，其在臨床上的應(yīng)用越來越廣泛。應(yīng)用前景十分廣闊。

1971年，福爾克和泰勒首先把抗體用膠體金標(biāo)記，獲得滿意結(jié)果。在此后的12年中，Holgate等人改進(jìn)了這個(gè)方法，將免疫金染色和銀顯影技術(shù)結(jié)合起來，免疫金染色被建立了。近年來，膠體金標(biāo)記技術(shù)在免疫轉(zhuǎn)印法、流式細(xì)胞儀法、液相免疫測(cè)定法、固相免疫滲透法和免疫層析法等領(lǐng)域有了進(jìn)一步的發(fā)展。金標(biāo)記抗體技術(shù)是醫(yī)學(xué)發(fā)展的又一里程碑。

膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)以膠體金為示蹤劑，將膠體金放置在硝酸纖維素膜載體上，使濾膜具有微孔過濾能力。使標(biāo)記的抗體或抗原與濾膜上的特定配體相結(jié)合，從而在毛細(xì)血管的作用下，獲取陽性信號(hào)，從而對(duì)抗體或抗原的定量或定性檢測(cè)起重要作用[1,2]。近幾年來，隨著免疫膠體金技術(shù)的不斷完善發(fā)展，研究人員根據(jù)膠體金的物理性質(zhì)，將基于膠體金標(biāo)記的生物檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步擴(kuò)展，并將其應(yīng)用到其他生物學(xué)領(lǐng)域。目前已廣泛應(yīng)用于被動(dòng)凝集試驗(yàn)、光鏡染色、免疫印跡、流式細(xì)胞術(shù)、液相免疫測(cè)定等[3]。遂本文以免疫膠體金技術(shù)在臨床檢驗(yàn)領(lǐng)域的應(yīng)用研究進(jìn)展為題，報(bào)告如下。

1.免疫膠體金優(yōu)點(diǎn)概述

它的表面是一種具有負(fù)電荷的疏水性粒子，粒子間的靜電排斥力使其在水溶液中保持溶解狀態(tài)。黃金溶液呈紅酒色澤，大顆粒呈紫紅色色澤。采用還原劑，氯化鈉(HAuCl4)可聚合成各種大小的金顆粒，形成疏水溶液，并具有負(fù)電性。因?yàn)殪o電作用而形成穩(wěn)定的膠體，因此稱為膠體金。金標(biāo)記，其實(shí)就是金顆粒包裹蛋白質(zhì)等大分子表面的吸附過程。吸附性的機(jī)理可能是金顆粒表面帶負(fù)電荷，靜電吸附后與正電荷基緊密結(jié)合。利用氯金酸還原法可制得不同尺寸和顏色的膠體金顆粒。該球形顆粒具有強(qiáng)大的蛋白質(zhì)吸附功能，可與葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白、多肽綴合物等多種物質(zhì)結(jié)合，成為基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)的重要工具。該技術(shù)主要利用了高電子密度的特點(diǎn)，在金標(biāo)蛋白交界處顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)金顆粒在相應(yīng)的配體上大量聚集時(shí)，肉眼可看到紅色或粉紅色的斑點(diǎn)，因此在定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中，也可通過銀粒沉淀來加強(qiáng)這種反應(yīng)，即免疫金銀染色。

因其對(duì)組織細(xì)胞吸附的非特異性較小，故特異性較強(qiáng)。用電子密度高的微粒標(biāo)記膠體金，電鏡下分辨率高，覆蓋的超微結(jié)構(gòu)少，易于與其他微粒結(jié)構(gòu)區(qū)分，定位準(zhǔn)確。金顆粒大小尺寸可控，通體勻稱，可進(jìn)行雙重或多重的標(biāo)記，也就是用不同大小的金粒，分別標(biāo)記不同抗體，在同一切片上可發(fā)現(xiàn)多種抗原，或與其他標(biāo)記配以雙重或多重標(biāo)記[4,5]。因金子本身呈鮮艷的橙色（無需添加發(fā)色試劑，省去酶標(biāo)記的致癌底物和終止步驟，對(duì)人體無毒），可用肉眼或采用光學(xué)顯微鏡觀察，也可用分光光度計(jì)定量?jī)x分析光吸收。不同切片范圍可獲得半定量的抗原。本發(fā)明還具有操作簡(jiǎn)單，快速，特異，靈敏度好，可一次測(cè)定，結(jié)果直觀，并能保存試驗(yàn)結(jié)果的特點(diǎn)（4°C保存2年以上，無信號(hào)衰減現(xiàn)象）、本標(biāo)記物制作簡(jiǎn)單，不需特殊儀器，且反應(yīng)時(shí)間短，反應(yīng)速度快，操作簡(jiǎn)單，無放射性同位素，無酶顯色底物，無致癌物質(zhì)，無熒光顯微鏡，制備工藝簡(jiǎn)便，無放射性同位素，無致癌物質(zhì)，適用范圍廣，除了應(yīng)用于光鏡、電鏡等免疫組織化學(xué)方法外，還廣泛用于各種液相免疫測(cè)定法、固相免疫測(cè)定法及流式細(xì)胞術(shù)[6]。

2.免疫膠體金技術(shù)方案概述

2.1 DIGFA檢測(cè)方案

二十世紀(jì)八十年代興起的DIGFA技術(shù)，經(jīng)過多年的技術(shù)革新和發(fā)展，已經(jīng)具有很高的診斷價(jià)值，其應(yīng)用前景也十分廣闊。如：在糞便隱血檢測(cè)中，膠體金法比鄰甲苯胺法具有更高的抗干擾能力和靈敏度。DIGFA是一種初篩檢測(cè)方法，在現(xiàn)場(chǎng)早期診斷中有較高的應(yīng)用價(jià)值，具有很好的應(yīng)用前景。有學(xué)者認(rèn)為，DIGFA法在檢測(cè)糞便隱血試驗(yàn)中比鄰甲苯胺法具有更好的抗干擾性能和靈敏度[7]。同時(shí)，也有學(xué)者將DIGFA、ELISA和流式微球載體技術(shù)分別用于檢測(cè)血清梅毒抗體，其特異性為100.0%，靈敏度依次為94.0%、96.0%和100.0%，并與DIGFA、ELISA和FMA等方法的檢測(cè)結(jié)果比較一致。

2.2 GICA檢測(cè)方案

自從上世紀(jì)90年代初發(fā)明GICA法以來，有關(guān)學(xué)者利用該方法檢測(cè)陰道念珠菌，結(jié)果表明，GICA法具有較高的靈敏度和特異性，優(yōu)于常規(guī)微生物培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢等方法。對(duì)早期妊娠患者進(jìn)行化學(xué)發(fā)光免疫分析和GICA分析，發(fā)現(xiàn)結(jié)果表明，在2～1000 IU條件下， IU小于2.0 IU時(shí)陰性檢出率高達(dá)100.0%，而在2～1000 IU條件下，弱陽性檢出率為97.20%，而在1000 IU條件下，兩者具有很強(qiáng)一致性，本課題的研究采用GICA檢測(cè)和免疫磁珠分離技術(shù)對(duì)大腸桿菌O157:H7進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，研究結(jié)果表明：GICA 1 ml7.6×103GFU/ml菌液經(jīng)免疫磁珠分離富集后檢出陽性；對(duì)10CFU/g大腸桿菌O157:H7進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)，經(jīng)6h預(yù)增后，GICA試條中可檢出72min，表明GICA檢測(cè)能較好地完成現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)[8-9]。采用心肌酶譜和心肌三聯(lián)膠體金法對(duì)急性心肌梗塞患者進(jìn)行臨床診斷，肌酸激酶酶同工酶的敏感性分別為96.30%、100.0%和85.2%，表明這種聯(lián)合檢測(cè)方法有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

2.3 半定量的檢測(cè)方案

研究人員認(rèn)為，硝酸纖維素的顯色面積與抗體濃度密切相關(guān)，因此建立了一種半定量的檢測(cè)方法[10]。采用免疫膠體金層析術(shù)，建立了通過半定量的快速且簡(jiǎn)便的檢測(cè)牛乳中新霉素殘留的方法。同時(shí)，也有一些學(xué)者建立了用DIGFA法檢測(cè)尿中微量白蛋白的方法，這種方法聯(lián)合散射免疫濁度測(cè)定尿中微量白蛋白符合率。

2.4 檢測(cè)方案-定量

以膠體金法定量測(cè)定硝酸纖維素膜的色澤深度與待檢物濃度之間存在著一定的比值關(guān)系。利用光敏掃描試劑條，通過與預(yù)制的標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)比，得到定量檢測(cè)結(jié)果。在檢測(cè)過程中，試劑條的檢測(cè)線顯色會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，試劑條的制作工藝、待測(cè)樣品及檢測(cè)環(huán)境的差異都會(huì)影響檢測(cè)過程和結(jié)果[11]。為此，一些學(xué)者提出了T/C比值的定量分析方法，這種方法主要是基于素膜上色色線與質(zhì)控線在顯色反應(yīng)中的影響相當(dāng)，通過兩線間的比率，能最大限度地消除溫度、時(shí)間及試樣的影響。由有關(guān)學(xué)者建立的免疫膠體金定量檢測(cè)方法，可準(zhǔn)確檢測(cè)待檢樣品中的金黃色葡萄球菌腸毒素B，其檢出限為8ng/mL，線性范圍為8～1000ng/mL，已基本滿足臨床檢驗(yàn)的基本要求。

2.5 方案-免疫電鏡

把免疫膠體金技術(shù)和電鏡技術(shù)結(jié)合起來，得到一種新型的膠體金技術(shù)，具有定位準(zhǔn)確，靈敏度高，特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。應(yīng)用膠體金免疫電子顯微鏡在臨床上的血小板膜糖蛋白的檢測(cè)結(jié)果表明，該技術(shù)能顯著提高血小板膜糖蛋白的檢出率，為進(jìn)一步研究血小板的功能提供了有效的依據(jù)。與傳統(tǒng)電鏡技術(shù)對(duì)比后發(fā)現(xiàn)免疫電鏡技術(shù)有許多不同之處，對(duì)于標(biāo)本的處理要求也特殊。經(jīng)常規(guī)電鏡術(shù)固定后的標(biāo)本，大部分抗原是可以部分或全部消失。實(shí)踐表明，以l%多聚甲醛和0.01%～0.05%的戊二醛混合使用效果最好。該固化劑不僅結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，而且效果良好。對(duì)某些抗原性較強(qiáng)的樣品，還可用4%多聚甲醛加0.05%～0.5%戊二醛固定。可用于多種抗原性染色的包埋劑，其聚合溫度必須能使脆弱的抗原變性，而且粘度大，容易吸潮，在一定程度上限制了其應(yīng)用。近幾年來，水溶性包埋劑逐漸在免疫電鏡上得到應(yīng)用，但由于價(jià)格昂貴，聚合條件要求比較高，在一定程度上限制了其應(yīng)用。在免疫電鏡技術(shù)中，免疫染色是非常重要的一步，在固定前、中、后的高溫聚合過程中，無需其他化學(xué)試劑，即可完成免疫反應(yīng)，更好地保留抗原性，方便地檢測(cè)某些弱抗原；缺點(diǎn)是保存的標(biāo)本形態(tài)結(jié)構(gòu)不理想，僅適用于新鮮組織，抗體滲透率低，不易進(jìn)行嚴(yán)格的對(duì)照研究。采用先做超薄切片再做免疫染色法包埋后染色，敏感性高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單，節(jié)省了抗體，保留了同一切片上的兩個(gè)或兩個(gè)以上的形態(tài)結(jié)構(gòu)，缺點(diǎn)是預(yù)處理的抗原破壞程度不同，不利于弱抗原的檢測(cè)。近幾年來，隨著固定包埋法和包埋法的改進(jìn)以及方法靈敏度的提高，包埋法的應(yīng)用范圍越來越廣，成為免疫染色的常用方法。即先用冰凍超薄切片機(jī)制制成超薄切片，然后不包埋染色進(jìn)行免疫染色。這種方法避免了包埋前染色和包埋后染色等多種因素影響，雖然有很好的應(yīng)用前景，但也出現(xiàn)了一些新的問題，如冰晶形成對(duì)超微結(jié)構(gòu)觀測(cè)的影響。膠體金免疫電鏡技術(shù)除了固定、包埋、聚合、蝕刻、免疫染色等方法外，有研究結(jié)果表明，在不同條件下，金的溶出度、膠體金和抗體的稀釋性、切片厚度、金的粒徑、非特異性染色和孵化時(shí)間是影響因素。為確保在背景清晰度的前提下獲得較強(qiáng)的陽性信號(hào)，應(yīng)適當(dāng)稀釋抗體和膠體金，并可用滴定法進(jìn)行檢測(cè)。酸堿度應(yīng)有利于抗原和抗體的保護(hù)，清潔應(yīng)該是徹底的，切片的厚度應(yīng)該在60～80nm之間。小顆粒膠體金一般認(rèn)為更容易聚集在抗原性部位，但直徑小于3 nm的金顆粒不容易被發(fā)現(xiàn)，可采用免疫金、銀增強(qiáng)的方法來提高敏感性。孵化時(shí)的溫度宜大于l2h。為去除非特異性染色及背景染色，人們普遍主張?jiān)诜趸疤砑?.5%～1%的卵白蛋白，1%～2%的牛血清白蛋白或正常羊血清白蛋白。

2.6 膠體金技術(shù)與核酸適配性納米磁性結(jié)合

近年來，隨著膠體金技術(shù)的不斷研究和發(fā)展，人們把它與核酸配體、納米磁性等結(jié)合起來，形成了兩種新技術(shù)。這兩種方法都屬于特異性鑒別元件，能夠在生物系統(tǒng)中分離目標(biāo)分子，發(fā)揮樣品濃縮的作用，從而大大提高了檢出率和靈敏度。在影響因子優(yōu)化的基礎(chǔ)上，建立了核酸適配子和蛋白質(zhì)親和力的分析方法和蛋白質(zhì)快速檢測(cè)系統(tǒng)。這種方法不需要對(duì)核酸適配子進(jìn)行任何修飾，操作簡(jiǎn)單，不需要昂貴而復(fù)雜的檢測(cè)儀器，而且肉眼可以觀察到結(jié)果，在設(shè)計(jì)上具有通用性，不僅可以用于適配子與靶蛋白的親合力研究和蛋白質(zhì)的定量檢測(cè)，而且在適配子與靶物質(zhì)的構(gòu)效關(guān)系的研究方面也有潛在的應(yīng)用前景。

2.7 方案-生物傳感器

近幾年來，生物傳感器中的膠體金技術(shù)應(yīng)用越來越多。已有許多關(guān)于信號(hào)放大免疫傳感器的報(bào)道，其中最常用的是通過改變阻抗信號(hào)來檢測(cè)抗原（抗體）含量。相關(guān)研究表明金標(biāo)記的免疫凝集能在叉指電極上被檢測(cè)到，并且膠體金的檢測(cè)技術(shù)采用的是免疫層析法。而用交聯(lián)聚苯包覆膠體金表面可提高電導(dǎo)法對(duì)金標(biāo)記免疫反應(yīng)的敏感性。采用納米金顆粒作為示蹤標(biāo)記物，根據(jù)檢測(cè)線金粒的富集情況，采用配套的光學(xué)定量檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)特征波長(zhǎng)反射率進(jìn)行檢測(cè)，得到樣品濃度。本文從HCG出發(fā)，成功地制備了HCG快速定量生物傳感器試條，并對(duì)其進(jìn)行了特征波長(zhǎng)和免疫膠體金最適抗體包被量的研究，選擇了530nm作為特征波長(zhǎng)，包被量為35μg/mL。利用這種生物傳感器配合自制的光學(xué)定量測(cè)試儀，在10～50μg/mL范圍內(nèi)對(duì)HCG抗原進(jìn)行了初步的檢測(cè)。本系統(tǒng)響應(yīng)快（15min），需樣少（20μL），可自動(dòng)定量判讀，測(cè)試用的傳感器試條成本較低（<0.6元），易于批量加工，同時(shí)系統(tǒng)具有通用性，可通過改變敏感膜，對(duì)多種免疫分子進(jìn)行定量判讀，并可實(shí)現(xiàn)多聯(lián)檢測(cè)。與之配套的定量分析儀器準(zhǔn)確度高，可以消除定性分析紙人工判讀的個(gè)別誤差，并能通過系統(tǒng)集成實(shí)現(xiàn)小型化。通過后續(xù)研究，提高了檢測(cè)靈敏度，降低了檢測(cè)限，可用于多種免疫分子的定量檢測(cè)，在臨床急救、社區(qū)農(nóng)村衛(wèi)生等方面具有很好的市場(chǎng)潛力。

2.8 聯(lián)合檢測(cè)方案

綜合各種檢測(cè)方法，多組分同時(shí)檢測(cè)，可以有效地節(jié)省費(fèi)用和時(shí)間，是檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向。用免疫膠體金技術(shù)制備的試紙，可同時(shí)檢測(cè)風(fēng)疹、巨細(xì)胞、單純皰疹等病毒和弓形蟲，與傳統(tǒng)ELISA方法相比，符合率極高，且二者一致[12]。

3.結(jié)束語

綜上所述,免疫膠體金法作為一種新型檢測(cè)法，具有操作方便等優(yōu)點(diǎn),相對(duì)于傳統(tǒng)的免疫熒光、免疫酶標(biāo)法和放射免疫法，該方法具有操作簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，但也存在易受環(huán)境因素影響的缺點(diǎn)。如血樣，尿樣本產(chǎn)生的背景噪音等，都會(huì)對(duì)儀器于的定量分析產(chǎn)生巨大影響。與傳統(tǒng)免疫檢測(cè)方法相比，免疫膠體法在靈敏度、檢出率等方面均有較大差距。有學(xué)者擬建立一套系統(tǒng)的膠體金檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)體系，在試劑質(zhì)量把控的前提下，保證免疫膠體金檢驗(yàn)的穩(wěn)定性，從而在急癥標(biāo)本、疫情現(xiàn)場(chǎng)等醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域具有重要意義。因此，我們還需要繼續(xù)深入研究，構(gòu)建新的檢測(cè)方法，使免疫流體技術(shù)在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域得到更廣泛的應(yīng)用，從而提高醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域的工作效率和準(zhǔn)確性。